01-肺癌基因检测

JSCH-BDDAllrightsReserved.基因检测在肺癌诊治中的应用江苏省肿瘤医院冯继锋JSCH-BDDAllrightsReserved.目录201肺癌精准治疗03检测路径的优化02EGFR检测在NSCLC的应用04检测质量控制JSCH-BDDAllrightsReserved.精准医学（precisionmedicine），又称为个体化医疗（personalizedmedicine），是指基于每个个体的基因差异而制定的个性化治疗方案。它的实质包括精准诊断和精准治疗两个方面。精准医学Hamburg,M.A.andF.S.Collins,NewEnglandJournalofMedicine,2010.363(4):301-304.JSCH-BDDAllrightsReserved.Genotypingandgenomicprofilingofnon-small-celllungcancerimplicationsforcurrentandfuturetherapies.JClinOncol.2013Mar10;31(8):1039-49.S.L.Woodetal.CancerTreatmentReviews41(2015)361–375肺癌精准诊断———从组织分型到分子分型JSCH-BDDAllrightsReserved.肿瘤精准诊疗的典范-肺癌为例同病同治同病异治核心点：精准诊断肺癌精准治疗AshleyJ.Vargars,NatureReviewCancer2016;16:525–537JSCH-BDDAllrightsReserved.35.5靶点选择越精确，患者治疗越获益1.SchillerJH,etal.NEnglJMed2002;346:92-98.2.ScagliottiGV,etal.JClinOncol2008;26:3543-3551.3.YangCH,etal.Presentedat2010ESMO.4.InoueA,etal.2011ASCOAbstract7519.5.MitsudomiT,etal.LancetOncol2009;DOI:10.1016/s1470-2045(09)70364-X.ECOG1594含铂两药化疗(N=1207)1JMDB顺铂/培美曲塞(N=618)2IPASS卡铂/紫杉醇(N=608)3NEJ002易瑞沙EGFR基因敏感突变患者(N=114)4WJTOG3405易瑞沙EGFR基因敏感突变患者(N=86)5中位生存期(月)8.011.817.427.705101520253035未经选择人群选择性人群突变人群非鳞癌患者腺癌、不吸烟患者JSCH-BDDAllrightsReserved.EGFR突变是亚洲人群中最主要的NSCLC驱动基因野生型(69%)EGFR突变(10%)1KRAS突变(7%)其他非小细胞肺癌约占肺癌的85%，EGFR在非小细胞肺癌的突变率约为40%。其他突变35%EGFR突变55%4KRAS突变10%腺癌鳞癌大细胞肺癌小细胞肺癌鳞癌25%5腺癌50%2,3大细胞肺癌10%小细胞肺癌15%1.QiongZ,etal..LungCancer.2015;87(2):117-121.2.朱雄增.临床与实验病理学杂志.2012;28(3):241-243.3.中国非小细胞肺癌血液EGFR基因突变中国专家共识.中华医学杂志.2015;95(45):3721-3725.4.KohnoT,etal..TranslLungCancerRes.2015;4(2):156-164.5.吴东平,等.实用肿瘤杂志.2014;29(5):408-412.JSCH-BDDAllrightsReserved.一线EGFR-TKI治疗8至14个月后进展，约2/3EGFR-TKI耐药患者发生T790M突变-14914PFS（月）1.LangerCJ.JClinOncol.2013;20;31(27):3303-3306.2.YuHA,etal.ClinCancerRes.2013;19(8):2240-2247.获得性耐药1IPASS：吉非替尼First-SIGNAL：吉非替尼WJTOG3405：吉非替尼NEJGSG002：吉非替尼OPTIMAL：厄洛替尼EURTAC：厄洛替尼LUX-Lung3：阿法替尼LUX-Lung6：阿法替尼T790M突变60%2MET扩增+T790M突变3%小细胞+T790M突变2%小细胞1%小细胞+MET扩增1%MET扩增3%未知18%HER2突变8%HER2+T790M突变4%第一、二代EGFRTKI耐药机制JSCH-BDDAllrightsReserved.从单一的定点检测发展到如今的动态监测A突变DNA模板突变正向引物G野生DNA模板突变正向引物单一位点的定点检测ctDNATumorvolumectDNA动态跟踪肿瘤的变化ctDNA中检测出T790M突变的中位时间早于临床PD2.2个月ctDNA丰度的变化和影像学肿瘤大小的变化相对应,甚至能更精确反映真实情况NewmanAMetal.NatMed.2014May;20(5):548-54.JSCH-BDDAllrightsReserved.单基因到多基因，同一基因单次检测到多次检测NSCLC推荐检测基因：EGFR、ALK、ROS1以及PD-L1对于EGFR突变患者出现疾病进展后要先进行T790M基因检测JSCH-BDDAllrightsReserved.肺腺癌人群经驱动基因筛选分类检测结果指导用药动态监测用药变化MitsudomiT,etal.NavClinOncol.201310(4):235-244.血液检测组织检测组织检测血液检测初治分子诊断耐药分子诊断“全程化分子检测”将成为NSCLC精准诊疗的发展趋势JSCH-BDDAllrightsReserved.目录1201肺癌精准治疗03检测路径的优化02EGFR检测在NSCLC的应用04检测质量控制JSCH-BDDAllrightsReserved.EGFRExonDistribution(%)184.01943.2207.62145.0Other0.3AccordingtoCOSMIC(v54)2耐药相关突变敏感相关突变19号外显子缺失突变、21号外显子L858R点突变及20号外显子突变占EGFR突变约90%JSCH-BDDAllrightsReserved.EGFR检测方法各种检测技术百花争鸣ARMSdPCRdPCRNGSSangerSeqARMSFISHIHCCTCJSCH-BDDAllrightsReserved.直接测序法JSCH-BDDAllrightsReserved.ARMSPCRARMSPCR（amplificationrefractorymutationsystem，扩增阻碍突变系统），根据已知点突变设计引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS引物与突变DNA模板链进行匹配，并使TaqDNA聚合酶启动PCR反应。突变的ARMS引物与野生型DNA模板不匹配。组织EGFR检测推荐使用ARMS方法JSCH-BDDAllrightsReserved.ddPCR（微滴数字PCR）微滴化实现靶标DNA的富集高灵敏度，更适用于待测序列与背景核酸高度相似（如肿瘤突变检测）的样本适合复杂样品的检测，终点PCR检测不依赖Ct值，不依赖扩增效率，无需内参JSCH-BDDAllrightsReserved.DigitalPCR技术优势ImpressStudy方法学19dels（n=260）L858R（n=253）T790M（n=246）血浆EGFR突变ddPCR48%28%57%QIAGENARMS37%20%15%P值P0.001P0.001P0.001I.灵敏度高，适合低丰度ctDNA0.03%II.一致率高，血浆检出率接近组织III.绝对定量，线形范围广IV.实时监测，早期诊断，预后参考JSCH-BDDAllrightsReserved.NGS技术原理示意图RNArtPCRFragmentationTargetenrichmentAttachbarcodeadaptorsSequencingSamplePreparation“Library”PreparationSecondaryDataAnalysis•Guidedassembly•QualityControlApplicationSpecificAnalysis•Readcounting•Variantcalling321SequencedataanalysisPrimaryDataAnalysis•Imageprocessing•SignalprocessingClinicalReportExtractionDNAFFPEFFZNWholeBloodMultiplexing“sampleDNAlabeling”JSCH-BDDAllrightsReserved.NGS用于多基因的检测1.NGS检测到36.1%患者含有T790M突变(深度影响检测率)，且这些患者都检测到EGFR敏感突变。2.在无T790M突变的患者中，检测到许多旁路基因发生突变。YingJin,etal.Oncotarget,2016(7),38.JSCH-BDDAllrightsReserved.EGFR检测方法比较ARMSPCRddPCRNGS突变类型覆盖已知突变已知突变已知和未知突变变异类型SNV、InDelSNV、InDelSNV、InDel、CNV、genefusion测序范围单一基因或数个基因单一基因或数个基因多个基因或全外显子测序检测限下限1%0.01%0.3%数据能否量化半定量（需有标准基线校正）可量化可量化实验操作难度******数据解读难度*****（专业实力差距大）出报告时间3-4天3-4天7-15天价格*******CFDA认证V--动态检测V（需有标准基线校正）VV新靶点探寻--V耐药机制探寻--VJSCH-BDDAllrightsReserved.77%19%1%1%1%1%ARMSpcr-荧光探针法液相芯片一代测序pcr-熔解曲线法荧光pcr-HRM法2015年PQCC（中国）质控项目2015年EMQN（全球）质控项目82%15%2%1%ARMSpcr-荧光探针法一代测序液相芯片国内EGFR突变检测技术的应用现状PQCC质评/CNAS：肿瘤EGFR/KRAS/BRAF基因突变（153家医院）ARMS法：是目前临床应用最为广泛认可的方法DatafromPQCCandEMQN(2015)JSCH-BDDAllrightsReserved.目录2301肺癌精准医学背景03检测路径的优化02EGFR检测在NSCLC的应用04检测质量控制JSCH-BDDAllrightsReserved.不同的临床治疗需求选择合适的检测方法I.位点鉴定-ARMSII.丰度定量-ddPCR，NGS5.9%11.8%13.0%6.5%12.1%11.5%12.5%14.3%0.0%5.9%13.0%19.4%27.3%29.5%33.3%48.2%0.0%0.0%0.0%6.5%3.0%3.8%4.2%3.6%0.0%10.0%20.0%30.0%40.0%50.0%60.0%70.0%m-8(n=17)-8≤m-6(n=17)-6≤m-4(n=24)-4≤m-2(n=34)-2≤m0(n=36)0≤m≤2(n=78)2m≤4(n=48)m4(n=56)EGFRmutationrateTimeagainstTKI-PD(month)19Dels/L858RIII.动态监测-ddPCRIV.耐药探索-NGSJSCH-BDDAllrightsReserved.不同类型的标本适合不同检测方法标本类型侵入性异质性动态监测质量控制诊断定位方法学组织标本++-+金标本ARMSNGS胸水标本++-+血液标本--+-有效补