经典开题报告

研究生：Tim3/Tim3L信号通路激活在Hp免疫致病及Hp疫苗免疫防治中的作用及其机制导师：研究背景研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究方法、手段、技术路线及可行性分析统计学分析课题创新之处年度计划及预期进展实验条件及经费预算Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病机体免疫反应在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保护中均起重要作用研究Hp感染的免疫致病机制及Hp疫苗防治机制有重大意义分泌IL-2、IFN-γ、TNF介导细胞免疫ThTh1Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13介导体液免疫反应Treg分泌IL-10、TGFβ免疫抑制Th1Th2IFN-γ(-)(-)IL-4Hp感染Th1占优势Th1和Th2失衡招募Treg感染持续存在Hp疫苗诱导Th1、Th2Th1和Th2失衡纠正Treg减少感染清除Tim-3是第一个被发现与T细胞反应有关的Tim家族成员表达在成熟Th1细胞膜上不表达在未成熟Th细胞、Th2细胞上包含Ig-V样结构域的信号肽、粘附素样结构域、跨膜区域、细胞内尾巴Tim-3激活后降低Th1反应Galectin-9是Tim-3的配体，主要表达在CD4+的T细胞Tim-3/Galectin-9通路的激活可导致Th1细胞效应功能的终止我们前期研究发现阻断Tim-3信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活NF-κBTLR信号的负性调控因子SIGIRR可上调Tim-3的表达提示：Tim-3和TLR4信号通路可相互调控我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少说明Tim-3信号通路在调节Treg控制炎症反应中起重要作用Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并且与TLR4信号通路和Treg密切相关TLR4信号通路Treg变化Th反应Tim-3/Tim-3LHp致病和疫苗免疫保护我们的研究还发现Tim-3阻断提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜内Hp定植密度加剧Hp疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程度提示Tim-3信号通路参与Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用问题：Tim-3信号通路激活，将会对Hp感染和Hp疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚体外研究体内研究研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察以下指标：小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化胃黏膜局部Tim-3表达、Treg和几个有代表性的Th1（IFN-γ、LI-12）和Th2（IL-4、IL-10）细胞因子含量的变化胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子（TLR4、MyD88、NF-κB）的变化。胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况淋巴细胞对Hp刺激的增殖反应Tim-3阳性细胞的数量培养上清液中Th1和Th2细胞因子含量CD4+效应T细胞中TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子的变化比较它们与未处理组的差异观察小鼠的脾淋巴细胞用Tim-3L(Galectin-9)预处理后与Hp共培养后：阐明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系阐明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系明确通过对Tim-3/Tim-3L信号通路的调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用体内研究未经处理组:①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组Tim3配体处理组：①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组体外研究未经处理组：①Hp刺激组②空白组Tim3配体处理组：①Hp刺激组②空白组Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂基础上，微需氧条件下（O25%、CO210%、N285%）37℃培养2-3天Hp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素（CT）和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠处死，取胃黏膜进行病理检查和Hp培养，确定Hp感染模型的建立6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，每只小鼠给予0.5ml含5ugCT和1.2mgHp抗原的PBS或0.5ml含壳聚糖微球-1.2mgHp抗原有效量的PBS，于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周给予109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次，共4次。末次攻击后4周处死小鼠，取标本检测各项指标在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μgGalectin-9用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml的Galectin-9预处理2h，按细胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，共同孵育24-48（3、6、12、24、48）小时后，测细胞的增殖反应，并收集细胞和培养上清，测各项指标采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内Treg采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞Tim-3阳性细胞采用ELISA法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含量采用细菌培养和组织学Giemsa染色法检测Hp采用MTT法进行细胞增殖试验流式细胞仪检测脾内Tim3阳性细胞胃粘膜内TLR4通路关键分子免疫组化、westernblotBALB/C小鼠未处理组Tim3配体组空白组Hp感染组疫苗组胃粘膜病理及Hp检测胃粘膜内Th1Th2细胞因子ELLISA检测鼠脾淋巴细胞Tim3配体组未处理组Hp刺激组空白组培养细胞Tim3阳性细胞流式细胞仪培养上清Th1Th2细胞因子ELISA检测培养细胞内TLR4信号通路分子WesternBlot细胞增殖试验MTT课题选题合理，具有理论基础课题所采用的技术均已建立，在技术上确保了本项目的完成本实验所需的仪器设备本单位基本齐全计量资料:①多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时采用秩和检验②多个样本的两组间比较采用SNK-q检验计数资料:采用X2检验等级资料：采用Kruskal-WallisH检验。P≤0.05时有统计学意义Tim3/Tim3L信号通路在Hp感染致病及疫苗免疫中作用研究国内外未见报道2011.12-2012.02查阅相关文献，完成综述2012.03-2012.04收集资料，完成各项准备工作，进行预实验2012.05-2012.12正式实验，并检测各项指标2013.01-2013.03整理数据并分析，统计处理，完成论文激活Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染和Hp疫苗免疫小鼠Th免疫反应、TLR4信号通路及Treg通过调节Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染结局及Hp疫苗免疫效果发表一篇SCI论文，题目为Tim3/Tim3L信号通路在幽门螺杆菌免疫致病及疫苗免疫中的作用及机制BALB/C小鼠2000元消耗材料费8000元WesternBlot20000元抗体70000元RT-PCR10000元细胞因子检测试剂15000元流式细胞检测费20000元总计135000元