6新型疫苗疫苗及其分类附加

新型疫苗一、转基因植物疫苗疫苗的研究和开发历程以全细胞疫苗为标志的第一次疫苗革命以乙型肝炎基因工程疫苗为典型代表的第二次疫苗革命第三次疫苗革命:基因疫苗研究转基因植物疫苗的技术基础重组基因技术实际上是重组DNA疫苗的一种生产疫苗的系统:高等植物转基因植物口服疫苗，例如水果、黄瓜、胡萝卜和番茄等转基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接种方便等优点，因此特别适合于包括中国在内的发展中国家的需要。转基因植物疫苗的研究方向一种是利用植物作为工厂采生产大量的蛋白质抗原，然后经过分离和提纯，再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。转基因植物疫苗的优越性(1)植物细胞的全能性植物的组织或原生质体在适当的条件下经培养能得到一株完整的可育的植物体。(2)完整的真核细胞表达系统在植物中表达的产物可进行糖基化、酰胺化、磷酸化和亚基的正确装配等翻译后的加工过程，使表达产物具有与高等动物细胞表达一致的免疫原性及生物活性。转基因植物疫苗的优越性(3)诱导粘膜免疫反应口服植物疫苗能诱导机体产生粘膜分泌性IgA。人体粘膜是阻挡某些病原体与人体接触的第一道屏障。粘膜免疫的产生对某些传染病，尤其是通过粘膜传播的传染病的预防是非常有效的。(4)生产简便、成本低廉用动物或微生物生产疫苗需要特殊的条件和设备，并需要冷藏和低温运输。植物种植是最经济的蛋白质生产系统。从消耗的能源来说，阳光是植物用之不尽的能源，营养来自土壤中的肥料、矿物质和水，无需专门的设施和昂贵的设备。转基因植物的种子可用以再生产和技术转让。非常适合发展中国家的需要。转基因植物疫苗的优越性(5)接种简便植物疫苗的接种途径主要是口服，无需注射。如果给婴幼儿喂服香蕉泥疫苗，不再受皮肉之痛苦，无疑会受到家长们的欢迎。(6)安全性植物疫苗在本质上是人类的食品，因此安全可靠，无毒性和副作用，也无潜在的致病和致癌的危险性。转基因植物种类的选择标准：该植物可以在世界上较多地区，特别是发展中国家种植，并能获得较高的产量；容易给婴幼儿喂服，并能获得家长们的接受；作为疫苗的植物可食用部位必须是可以生食的，并且有较高的蛋白质含量(1)烟草烟草一直是进行植物组织培养和遗传转化的模式植物，较为容易获得转基因植物。虽然烟草含有尼古丁等有害物质，但其蛋白质含量丰富，可通过纯化技术获得蛋白质，所以较适合于如乙型肝炎等转基因植物疫苗的生产及应用研究。(2)马铃薯遗传转化系统已经建立，在很短时间内即可获得大量的转基因植物；可食用的块茎组织特异性启动子已被克隆，可以使外源基因在块茎内特异地大量表达。组织培养快速繁殖系统业已成熟，可以供应大量遗传背景一致的种苗。马铃薯可以作为很多动物的食物，所以动物实验绝无问题。致命的缺点:即马铃薯块茎蛋白质的含量较低，而且人类无生食马铃薯的习惯。(3)香蕉在发展中国家有大量的种植，而且价格非常便宜。每个香蕉可以表达1～10mg左右的外源基因蛋白质，大约100～500μg的蛋白质抗原就足以刺激人体产生特异的免疫反应，因而一个转基因的香蕉疫苗就能给10个婴幼儿进行口服免疫接种。其他植物豆类植物的种子虽然含有较高的蛋白质，而且转基因豆类作物的研究也有较多成功的报道。但是豆类种子中含有凝集素类物质，因而不能生食。大部分蔬菜和水果类植物含有较多的水分，蛋白质的含量很低，显然也很不适合作为转基因植物疫苗的表达载体。非直接口服的转基因植物疫苗乙型肝炎表面抗原疫苗目前市场上用的疫苗是用酵母细胞系统生产的DNA重组乙肝病毒表面抗原疫苗将乙肝表面抗原基因转入烟草的基因组,结果发现烟草成功表达了乙肝表面抗原。乙型肝炎表面抗原疫苗发现烟草源性的乙肝表面抗原能够产生抗乙肝表面抗原的抗体，除了IgG1低于酵母源性疫苗外，IgG2、IgG3、IgM和IgA的滴度均高于后者。这些抗体能识别人血清中的乙肝表面抗原。体外实验也证明烟草源性的乙肝表面抗原保留了相同的T细胞及B细胞抗原决定簇。虽然烟草源性的乙肝表面抗原产生抗体比较慢，而且滴度略低于现有的疫苗，但烟草提取液只含3％的蛋白质，而酵母源性的疫苗却是纯化的蛋白质制剂。诺瓦克病毒衣壳蛋白引起腹泻。Mason等人用烟草来表达诺瓦克病毒衣壳蛋白取得成功。表达量达到烟叶总蛋白质含量的0．23％。对这种植物源性的蛋白质结构进行分析发现，它不但保留了抗原决定簇，而且能更加耐受蛋白酶的分解。在电镜下观察，其形状类似于NVLPs。用转基因马铃薯去喂小鼠，在小鼠血清中测到了抗诺瓦克病毒的IgG和IgA抗体。狂犬病病毒糖蛋白McGarvey等人将狂犬病病毒的表面蛋白在番茄中表达，且表明它能与病毒天然蛋白质产生的多克隆抗体形成免疫沉淀。他们还用植物病毒为载体得到狂犬病植物疫苗，并且在被免疫的小鼠血清中测到了中和抗体。直接口服的转基因植物疫苗大肠杆菌肠毒素植物疫苗产肠毒素型大肠杆菌引起腹泻在感染性腹泻的免疫机制中，粘膜免疫重要用转基因植物作为口服疫苗有可能产生理想的粘膜免疫反应，从而达到预防腹泻性传染病的目的。Mason等人于2019年根据这个原理将LT-B的编码基因转入烟草及马铃薯，研制成功转基因植物疫苗结核转基因植物疫苗卡介苗结核DNA疫苗已在小鼠实验中获得了可喜的免疫保护效果口服能表达结核杆菌蛋白质抗原的植物，有可能在肺部产生特异IgA抗体等粘膜免疫反应把结核杆菌分泌性蛋白质MPT-64和ESTA-6基因导人烟草、黄瓜、番茄和胡萝卜的研究正在进行之中，其中MPT-64蛋白质的基因已经在番茄中获得了成功的表达。动物传染病的转基因植物疫苗家畜都是生吃植物的，因而转基因植物的选择范围比较广。Carrillo等报道了他们用编码家畜口蹄疫病毒结构蛋白VP1的基因转入到植物拟南芥中，然后用转基因植物的叶子提取液来免疫小鼠，发现产生的特异性抗体能保护小鼠抵抗口蹄疫病毒的侵袭。转基因植物疫苗研究的发展方向优化重组基因无抗生素抗性的转基因植物转基因植物疫苗的稳定性优化重组基因①在插入基因的3’端加上微粒体保留信号SEKDEL多肽序列，使合成的蛋白质能保留在细胞的内质网部位，不会分泌出来，从而提高产量。②选择特异的启动子。花椰菜花叶病毒35S启动子是一个常用的启动子，适合于多种植物。对马铃薯来说，patadin启动子更为适合。在启动子3，端加上烟草蚀刻病毒5，端的非翻译区也是一种提高表达的方法。③编码甘氨酸的GGG在单子叶植物基因组中非常少见，因此将插入基因中的这一编码改为GGA是一种更适合在植物中表达的方法。④其他的方法包括去除虚假的mRNA加工信号、减少A—T含量、选择植物偏爱的密码子等。无抗生素抗性的转基因植物在转基因植物的再生过程中抗生素作为筛选标记被广泛应用。人类和动物在口服疫苗后，抗生素基因也势必由此进人体内，这会使人感到担忧。有关在转基因植物的子代去除抗生素基因的策略已有不少。这些策略包括cre／lox重组子和转座子系统，或利用改变代谢途径和共转化等方法。其中共转化较容易操作，其基本原理是将一个具有抗生素标记的质粒和另一个仅含目的基因质粒同时导人同一农杆菌。由于不同质粒的基因一般插入到植物基因组的不同部位，可以通过有性生殖而分离，在子一代的植株中就可以筛选得到无抗生素基因而只含有目的基因的转基因植物。转基因植物疫苗的稳定性植物细胞壁的天然生物胶囊作用虽然能使植物疫苗避免在消化道中过早降解，但如果它久久不能释放也显然是致命的缺点。寻找一个最佳平衡点，使植物疫苗在最合适的部位发挥作用也是一个研究方向。展望虽然植物疫苗离临床应用还为时尚远，但这一领域充满了希望，吸引着广大科学研究者。在众多转基因植物疫苗的研究中，最有可能成为商品化的植物疫苗是转基因香蕉。香蕉具有其他植物无可比拟的3大优点：①香蕉泥已经是能被广泛接受的婴幼儿食品②香蕉是蛋白质含量最高的水果之一③香蕉有厚实的外皮，保存和运输都十分方便。二、黏膜疫苗粘膜是人体先天性免疫系统中很重要的防止病原微生物入侵的生理防线粘膜能将机体的内环境和外环境隔离开来，有效地将致病因子和对机体有害物质拦阻在外；粘膜的分泌液可防止病原微生物在其表面生长，并可通过排泄或咳痰等生理过程将它们清除出去黏膜免疫系统的组成亦称为黏膜相关淋巴组织(MALT)是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结(Peyer'spatches，PP)及阑尾等。黏膜免疫应答的诱导启动黏膜免疫发生的场所主要是一种特化扁平上皮细胞-微褶细胞(microfoldcell,M细胞)其功能为选择性黏附,摄取外来抗原物质并以小囊泡形式转运给上皮内淋巴细胞以及生发中心淋巴组织,诱导黏膜免疫应答M细胞--各种病原微生物侵入机体的门户M细胞(microfoldcell)是表面具有粗糙皱折结构，覆盖在粘膜表面的滤泡相关上皮组织FAE中M细胞的表面是稀疏的绒毛状结构，这有利于M细胞摄取大分子抗原，甚至细菌和病毒，抗原穿越粘膜的屏障，传送到下面的淋巴组织中去，诱导产生特异的粘膜免疫反应M细胞总结M细胞是诱导和产生粘膜免疫反应场所的门户，在那里发生了细胞的内饮和抗原的传送、及随后的病原微生物的杀灭、抗原的加工、处理和呈递，以及抗原的储存等一系列过程，最后诱导和产生了粘膜免疫反应。黏膜免疫的优点口服疫苗可在粘膜局部产生特异的抗体反应，来有效地阻止病原微生物的入侵甚至将其杀灭和清除出体外。通过口服或滴鼻接种疫苗，可以使机体全部的粘膜获得抵御相应传染病的免疫保护力。粘膜免疫也能产生很高的血清抗体效价，甚至能诱导细胞毒T淋巴细胞的活性。接种比较方便，副作用小，安全性好，生产方便，成本也比较低。人用黏膜疫苗脊髓灰质炎疫苗灭活霍乱全细胞B亚单位疫苗和减毒灭活苗减毒伤寒疫苗BCG活疫苗腺病毒疫苗AIDS疫苗?IgA抗体介导的粘膜免疫保护效果抗原的摄取、加工、处理和呈递，并激活抗原特异性的淋巴细胞，然后通过局部的淋巴结，进入全身性循环，再回到粘膜组织产生第二阶段的免疫效应。此时的B淋巴细胞产生了克隆性的增殖，在再度接触抗原和辅助性T淋巴细胞分泌的细胞因子的作用下，发生了向IgA浆细胞分化的过程，进而产生大量的特异性IgA抗体IgA抗体免疫球蛋白总量的80％是IgA抗体在粘膜局部合成的分泌性sIgA，每天随分泌物排泄出去的sIgA的数量可高达10g分泌性IgA的结构与功能sIgA的多聚体结构能增强其对抗原和病原体的亲和力；sIgA表面特殊的糖成分或糖链有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。粘膜上皮细胞产生的分泌体(secertorycomponent，SC)很快以二硫键共价连接成sIgA并分泌到粘膜的表面,能延缓小肠中蛋白酶对sIgA的降解作用，却不影响它与抗原的亲和力。黏膜免疫途径鼻腔免疫和口服在许多情况下，鼻腔免疫更为有效，所需的疫苗量和佐剂量一般较小，且可以靶向病原体侵入的天然门户，同时避免了胃肠道的酸性环境及酶的作用对抗原的破坏黏膜免疫在禽病防治中的作用1.经滴鼻、点眼、饮水和喷雾途径免疫弱毒活疫苗，均可产生SIgA而建立相应的黏膜免疫力。2.检测雏鸡l—5日龄期间，局部免疫器官包括眼结膜和哈氏泪腺内，缺乏免疫活性细胞和黏膜抗体，而当1日龄接受疫苗免疫后，该部位的免疫活性细胞开始增多，说明早期免疫对免疫器官的活化至关重要。艾滋病黏膜疫苗的现状及未来方向胃肠道和阴道黏膜是HIV进入机体和初始感染的主要部位,能预防HIV感染的疫苗必须能够诱导长期的黏膜免疫应答实验证实,小鼠口服免疫包裹于微粒的质粒DNA能产生HIV特异性全身及黏膜CD8+CTL应答。另一项小鼠研究中,仅在阴道或直肠局部免疫HIV重组Sindbis病毒后方可观察到抵抗HIV重组Sindbis病毒攻击的保护作用,而肌肉注射或经远端黏膜部位(如鼻腔)接种相同疫苗载体则不能为小鼠提供抵抗阴道攻击的保护作用。三、治疗性