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羊的胚胎移植一、胚胎移植概述二、胚胎移植原理三、胚胎移植技术程序一、胚胎移植概述1.胚胎移植的发展历史2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用3.胚胎移植目前存在的问题4.影响胚胎移植的主要因素5.胚胎移植的经济效益6.胚胎移植的发展前景1.1国外胚胎移植发展史George是世界上第一个提出动物胚胎移植的人。1890年4月，WalterHeape用兔作为实验动物，成功地获得了世界上第一个动物胚胎移植后代。Heape兔胚胎移植的成功，极大的影响着繁殖生物学和畜牧业的发展。1900年，Heape的杰出接班人FHAMarshall和JohnHammond总结了他的主要工作内容，提出了哺乳动物性季节的概念，也就是现在所说的发情周期。1911-1913年，奥地利维也纳的Biedl等进行了兔的胚胎移植实验，但由于战争，直到1922年才报道了其研究结果。虽然他们做了70多个实验，但由于把输卵管的胚胎移植到子宫，结果只有一只受体兔妊娠，这充分证明了胚胎和受体的同步性是非常重要的。1932年和1933年，Warwick,Berry和Horlache第一次把胚胎移植技术用在绵羊和山羊上，Dr.Berry也因此成为了第一个国际胚胎移植协会先驱奖的获得者。1948年，张明觉用超数排卵技术从2只母兔获得88枚受精卵，给7只受体母兔移植，成功地产出76只小兔，这次试验的成功具有划时代的意义。1950年12月19日，33岁的美国人ElwynWilled成功地获得了世界上第一头胚胎移植牛犊。60年代初，全部采用的是手术回收胚胎和移植，1964年Mutter等和1965年Sugie相继报道了非手术移植胚胎获得成功。70年代中期，牛的非手术移植完全取代了手术移植.1974年，成立了国际胚胎移植协会(IETS)，随后相继成立了美国胚胎移植协会、加拿大胚胎移植协会、欧洲胚胎移植协会1.2国内胚胎移植发展史我国的胚胎移植研究起步较晚，于20世纪70年代初才开始。1973年首先在家兔上获得成功。1974年，中科院遗传所在绵羊胚胎移植上取得成功。1976年郭志勤、谭丽玲等在家兔胚胎和绵羊胚胎低温(100C)保持1天和10天后移植成功。手术法和非手术法牛胚胎移植在1978年和1980年也相继成功。1980年中国农业科学院畜牧所在绵羊胚胎超低温保存后移植产羔。20世纪80年代，胚胎移植进入了实验阶段，掀起了全国的研究高潮，20几个省近30个单位相继开展了胚胎移植研究工作。20世纪90年代初期，我国的胚胎移植工作逐渐进入了生产应用初始阶段。生产应用比较好的地区主要是内蒙古、新疆和黑龙江、北京1.3羊的胚胎移植发展历史羊胚胎移植的商业化应用已有近40年的历史。在国际上，胚胎移植以牛的比例最大，其次为绵羊和山羊，其它家畜和动物胚胎移植(猪、鹿、马等)的研究相对较少，但近些年来也逐渐成为一个比较热的研究方向。在国内，羊的胚胎移植起步较发达国家要晚一些，近十几年来，才逐渐推广开来，前几年由于波尔山羊的大量引进而使山羊的胚胎移植研究也相对多了起来。全国二十多个省进行了波尔山羊的快繁技术项目的实施。2003年我国共生产波尔山羊、良种肉用绵羊胚胎40000枚左右，移植受体30000只以上。2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用（1）超数排卵技术能充分利用优秀种母畜的繁殖潜力，几十倍或成百倍地提高母畜的繁殖效率和后代的增长速度。（2）克隆技术可实现同卵双生、同卵多生动物或无性繁殖后代，快速增加良种动物的数量，或为育种提供材料。（3）可使优秀种畜遗传资源得到充分利用，加速育种速度和畜牧良种化进程。(4）能用胚胎代替活畜运输，可在世界范围内实现品种交流，节约运输费用，减少疫病传播。（5）用于建立胚胎库或基因库，使畜禽良种、珍稀物种(基因)能长期保存，对利用、保存优良基因或拯救濒危灭绝动物具有重大意义。（6）可用于治疗动物和人类的不育。如：体外受精技术，特别是显微受精技术。3.胚胎移植目前存在的问题（1）胚胎来源限制了NT的效率和实际应用（2）缺乏熟练操作技术人员及我国优秀畜种比例低（3）ET费用高，人力和时间耗费大，条件严格制约了其推广应用（4）胚胎冷冻保存任存在很多问题（5）胚胎采集和移植主要采用手术法的畜禽易造成粘连，受体重复使用受限制（6）超排效果不够稳定、移植成功率低、超排效果不够稳定4.影响胚胎移植的主要因素（1）超排技术：超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，可以为胚胎移植受体提供优质、丰富的胚源，保证优良母羊发挥最大的繁殖潜能。但影响超排的因素也很多，如超排使用的药物种类，来源，生产厂家，使用剂量，操作程序等（2）移植胚胎的质量：胚胎质量的好坏是胚胎移植能否成功的关键因素。通过胚胎鉴定，要选择具有形态结构完整紧凑、轮廓清楚、呈球形、分裂球大小均匀、色调和透明度适中及无附着的细胞和液泡等特征的一级（A级）、或二级（B级）胚胎进行移植。（3）供体、胚胎与受体的同期化程度：供、受体之间的子宫内膜要与胚胎的发育相同步，这是胚胎从体外培养环境到体内并发生妊娠必须具备的重要条件之一。这就要求供体与受体在发情时间上要同期，或移植的胚胎日龄与受体发情时间是同步，一般供、受体发情同步差为24h以内最理想。同步差越小，越有利于胚胎的发育，移植成功率越大（4）移植胚胎的数目：一般认为，妊娠率与移植高质量的胚胎数成正相关，移植1枚、2枚和3枚胚胎受体的妊娠率差异不显著，但产羔率却依次增加。也有研究报道，当移植胚胎数超过6枚时，妊娠率反而下降。据研究单侧移植:2-3枚效果最佳，进行大规模的胚胎移植时，还要考虑受体羊的体况、产羔时繁重的接羔任务及产后受体羊的哺乳能力等。（5）操作技术：胚胎移植的每个操作环节在实际操作中都十分复杂，都直接影响胚胎移植的成败。尤其手术操作要求熟练、稳重、轻巧、速度适宜。向宫腔内注入移植液和胚胎时速度不能过快，否则胚胎会随移植液进入输卵管而发生异位妊娠；如果速度太慢，子宫、输卵管等暴露于空气时间过长，增加污染率，同时也增加了胚胎的损伤率。术者手、臂、手术器械等对子宫的强烈刺激，对输卵管进行强拉硬拽都会产生不良影响（6）其它：受体本身的黄体发育与孕酮含量、解冻剂与脱防冻剂的类型、胚胎移植的季节、供体年龄及营养状况等因素都不同程度影响胚胎移植的成功5.胚胎移植的经济效益胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风险。如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植可创造较好的经济效益。6.胚胎移植的发展前景胚胎移植技术虽然已较成熟，但对不同种属、不同品种和不同个体的动物如何改善超排效果，简化技术操作过程，提高移植妊娠率方面还有很多工作要做。畜牧业的发展和动物胚胎工程技术研究的深入为胚胎移植技术提供了广阔的市场和美好的前景。绵羊胚胎移植技术的研究已经逐步由试验研究向商业化生产阶段转变。这一技术在生产中的广泛应用，充分发挥了优良绵羊品种的遗传优势，较快地实现在短时间内提高绵羊的良种化程度，不仅促进养羊业的发展，也为当地经济繁荣带来广阔前景。对绵羊胚胎移植产业化进行研究，必将对肉羊新品种的引进和肉羊生产开发产生积极的推动作用。。各种胚胎工程技术的研究和发展都需要胚胎移植技术作为必要的技术手段，所以动物胚胎移植技术的应用前景十分广泛第二节：胚胎移植的原理1.胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则1.胚胎移植的生理学基础1.1同种动物的供、受体的生殖器官的生理变化是相同的，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。1.2早期胚胎在一定时间内处于游离状态，为胚胎的收集提供了可能。1.3受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体内的存活提供了可能。1.4供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受任何影响2.胚胎移植的基本原则2.1.胚胎移植前后所处环境的一致性：⑴是供体和受体种属上的一致性。即二者属于同一物种，但这并不排斥种属不同但在进化史上血缘关系较近、生理和解剖特点相似个体之间胚胎移植成功的可能性。⑵是生理上的一致性。即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降。⑶是胚胎收集和移植部位的一致性。即从供体输卵管内收集到的胚胎应该移植到受体的输卵管内，从供体子宫内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫内。2.2.胚胎发育的期限：从生理学的角度讲，胚胎收集和移植的期限不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日以及胚胎附植之前进行。因此，胚胎收集多在发情配种后的3～8天内进行，受体在相同的时间内接受胚胎移植。2.3.胚胎的质量。在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素(物理的、化学的、生物的)的影响，移植的胚胎须经过鉴定确认是发育正常的.第三节：胚胎移植技术程序1.供体和受体的选择2.同期发情和超数排卵处理3.供体母畜的配种4.胚胎的收集5.胚胎的检查6.胚胎的保存与培养7.胚胎的移植8.供体和受体的术后观察1.供体与受体的选择供体羊：选择经济价值较高，应以品种优良、生产性能好；遗传性能稳定、谱系清楚；体质健壮、繁殖机能旺盛，无遗传病、生殖道疾病和传染性疾病。年龄在2.5~6岁以内为宜；产羔历史清楚、性周期正常；产羔60天以上，经观察至少有两个以上正常发情周期的母羊。与之交配的种公羊要求：谱系清楚，检疫合格，遗传性稳定，生产性能优良，符合本品种特征，精液品质良好。受体羊：繁殖性能良好、发情周期正常、无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在7成以上；年龄在1.5--6岁之间；经观察有两个正常发情周期的母羊。2.同期发情和超数排卵处理绵羊同期发情(synchronizationofestrus)是利用某些外源激素人为地控制并调整一群母羊发情周期的过程。其药物机理一是对群体母羊同时使用某种激素，抑制卵巢上卵泡的生长发育，经过一定的时间后停药，使卵巢机能恢复正常，引起同期发情。其实质是延长了发情周期，推迟了发情期。二是使用性质完全不同的另一种激素，抑制黄体，加速其消退，缩短黄体期，为卵泡期提前到来创造条件。黄体退化将导致母畜发情。其实质是缩短了发情周期，使发情期提前到来。主要方法有：PG二次注射法、CIDR+PG法、MAP（甲羟孕酮）法.通常使用氟孕酮阴道海棉栓埋植或埋植CIDR，被认为是控制母羊同期发情最可靠、最准确的方法。超数排卵（superovulation）：是在母羊发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢比在自然状态下有更多的卵泡发育并排卵的技术，简称超排。主要应用于牛、羊，效果明显，对于多胎的猪意义不大，母马则很难产生反应。应用超排技术可使羊每次排卵由1-4个增加到10-20个或者更多。作用：发挥母畜优良繁殖潜力；促进家畜改良速度，加快遗传进展。常用的激素有FSH、LH、PMSG、hcG、PGF2α、PGc和孕激素等。影响超排效果的因素造成超排效果(获卵率和可用的胚胎数)不稳定的因素主要有两大类:一类是动物因素,包括个体和遗传的差异、生理和营养状态、开始超排的日期、季节及其它影响动物的环境因素;另一类是药物因素,包括激素的半衰期、激素制剂中的FSH/LH比例、给药途径、剂量和频率等常用的超排方案：（1）FSH法：FSH+PG法、CIDR+FSH+PG等（2）PMSG法：PMSG+hcG或PG研究表明，PMSG超排后适时给予APMSG，可显著改善羊卵巢反应，增加可用胚胎数(武浩，1997)。（3）FSH预处理.Rejamahendran等在发情周期的第3d和第4d给予2.5mgFSH作预处理，结果比正常FSH程序回收到的卵子多4枚(P0.05)，每头母牛回收的优质胚胎增加1.6枚。但试验表明排卵数并未提高(Lussier,1989)。目前羊超排多用FSH多次注射法，超排效果稳定，一般不会出现卵巢囊肿和持续发情等现象，但多次注射费人、费力，而且易引起剂