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1实验一、光学显微镜的基本使用方法一、实验目的1.了解光学显微镜的结构、原理和保养方法；2.掌握光学显微镜的操作。二、实验要求1．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排；2．认真听讲，不懂就问；3．完成实验报告三、实验仪器和材料1．光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯2．微生物示范片：蛙血涂片四、显微镜的结构、光学原理及其操作方法（一）显微镜的结构和光学原理显微镜分机械装置和光学系统两部分。1．机械装置（1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为160mm）和后倾斜式（倾斜45°）。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。（2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。（3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。2（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。（5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。（6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。2．光学系统及其光学原理（1）目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如，5倍（5×）、10倍（10×）和15倍（15×），高级显微镜除了上述三种外，还有20倍（20×）的。（2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8×、10×、20×三种）、高倍（40×或45×）及油镜（100×）。物镜的性能由数值孔径（N.A.）决定，数值孔径=n.sinα/2，其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.52，用油镜时光线入射α/2为60°，则sin60°=0.87。以空气为介质时：N.A.=l×0.87=0.87以水为介质时：N.A.=1.33×0.87=1.16以香柏油为介质时：N.A.=1.52×0.87=1.32显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用δ表示，A.Nλ/61.0δ（λ为波长），分辨率与数值孔径成正比，与被长成反比。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使目的物的细微结构更清晰可见。事实上可见光的波长（0.38～0.7μm）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。物镜上标有：N．A．1．25、100×、“OI”、160/0.17、0.16等字样，其中N．A．1.25为3数值孔径，100×为放大倍数，“160/0.17”中160表示镜筒长，0.17表示要求盖玻片的厚度。“OI”表示油镜，（即OilImmersion），0.16为工作距离。显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。（3）聚光器：聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可上、下调节，它中间装有光圈可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。（4）反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。（5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。图1.普通光学显微镜4五、实验步骤及内容1．低倍镜的操作（1）置显微镜于固定的桌上。窗外不宜有障碍视线之物。（2）旋动转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。（3）转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜（选用适当放大倍数的目镜）仔细观察，使视野亮度均匀。（4）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央。（5）将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.50cm处时停止旋转。（6）左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。（7）如果粗调节器旋得太快，使超过焦点，必须从第（5）步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。（8）观察时两眼同时睁开（双眼不感疲劳）。单筒显微镜应习惯用左眼观察，以便于绘图。2．高倍镜的操作（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移到视野正中处。（2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。3．油镜的操作（1）如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。5（2）在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调（切记不用粗调节器）即可。（3）油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。4．用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。六、数据整理七、实验过程中应注意事项及心得1.取、送显微镜时要轻拿轻放，一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。不可把显微镜放在实验台的边缘，以免碰翻落地。取拿显微镜罩子的时候也一定轻取，以免将目镜从镜筒上带出摔坏。2.显微镜的光学部分只能用特殊的擦镜纸擦拭，切忌乱用他物擦拭，更不能用手触摸透镜，以免汗液玷污透镜。3.转换物镜时，不要用手直接旋转物镜镜头，只能转动物镜转换器。4.使用高倍物镜时，勿用粗准焦螺旋调节焦距，以免移动距离过大，损坏物镜和玻片。5.调节显微镜的焦距从低倍到高倍，用油镜时，直接从低倍到油镜。6.油镜使用过后应用擦镜纸蘸二甲苯擦拭干净，如此两次，第三次用干净的擦镜纸直接擦拭镜头。八、思考题1．如何保养和维护好一台光学显微镜？2．油镜为什么要先用低倍和高倍镜检查？先用低倍镜和高倍镜观察，可逐渐缩小视野范围，选取目的物，便于观察。6实验二、各类细胞形态的观察一、实验目的1.了解动、植物细胞的一般形态结构特点；2.初步掌握临时玻片标本的制备方法；3.掌握显微测量的基本方法；4.初步掌握光学显微镜下所见细胞、组织结构的绘图记录方法；5.进一步掌握光学显微镜的规范使用方法。二、实验原理细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。构成人体和其他高等动植物的细胞种类繁多，形态各异。有球形、椭圆形、扁平形、立方体、长梭形、星形等。细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩功能的肌细胞呈长梭形或条形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状凸起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。高等生物体不同细胞的大小差异很大，其直径大多数在10-100um，一般都需借助显微镜才能看到。由于细胞较小，而且其内含有较大比例的水分，故大多数是无色透明的，如果不经过染色处理，在显微镜下很难看清细胞的结构。因此，要观察细胞时，通常先进行染色处理。虽然细胞的形态、大小和功能各不相同，但在普通光学显微镜下，一般可见人体及动物细胞的基本结构可分为细胞膜、细胞质和细胞核三部分。但也有例外。哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。植物细胞的基本结构可分为细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核四部分。任何动、植物细胞都具有特定的形态结构，对其进行固定和染色等处理，便可以在显微镜下分辨清楚，然后借用目镜测微尺和镜台测微尺，便可测量大小。三、实验用品7材料与标本：洋葱、人口腔粘膜上皮细胞、人血涂片标本、神经元细胞标本仪器与器材：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、目镜测微尺、擦镜纸、吸水纸、手术器材一套、消毒牙签、解剖盘一个、小平皿两个试剂：1%甲苯胺蓝、1%碘液，1%甲基蓝、瑞氏染液、Ringer氏液四、实验方法步骤（一）洋葱鳞茎表皮细胞的标本制备取干净载玻片，中央滴一滴1%碘液；取洋葱鳞茎，用镊子在其内表面轻轻撕取一小块方形膜质表皮（边长3-4mm），置于载玻片的碘液中，铺平。用镊子夹取干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓的盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。（二）人口腔粘膜上皮细胞的标本制备取干净载玻片，中央滴一滴1%碘液；用一根灭菌的牙签轻轻刮取颌部任一侧的上皮。然后将它涂在载玻片的碘液中，并轻轻搅动几下使细胞分开。用镊子夹取干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓的盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。（三）蛙血涂片标本观察（四）人血涂片标本观察（五）神经元细胞标本观察（六）神经元细胞标本观察四、实验结果记录（一）各类动植物细胞形态观察1.洋葱鳞茎表皮细胞标本的观察将制备好的临时玻片置于低倍镜下观察，可见洋葱鳞茎表皮是由许多长柱状、排列整齐且紧密的细胞组成的（图1）。选择其中一个较典型的细胞移至视野中央，再转换高倍镜仔细观察一下结构（图82）：（1）细胞壁：为细胞最外层的一层由纤维素组成的较厚结构，它是植物细胞的重要特征之一。细胞膜位于细胞壁内侧并与其紧密相贴，光镜下不易分辨。（2）细胞核：位于细胞中央或者靠近细胞边缘，呈圆形或者卵圆形，染成深黄色。转动细调螺旋，在细胞核内可以看见1-2个遮光较强的核仁。（3）细胞质：细胞膜与细胞核之间的区域是细胞质，染成浅黄色。其中可以见到一至数个液泡，液泡内充满清澈明亮的液体。图1.洋葱鳞茎表皮细胞（100×）图2.洋葱鳞茎表皮细胞（400×）2.人口腔粘膜上皮细胞标本的观察将制备好的口腔粘膜上皮细胞玻片标本置于显微镜下观察，先用低倍镜观察，可见呈不规则形9或扁平椭圆形或多边形的细胞，单个或者多个连在一起。这就是口腔粘膜上皮细胞。选择轮廓清晰而无重叠的细胞，移至视野中央，转换高倍镜观察。高倍镜下，可清晰地看到细胞外形扁平而不太规则，中央有一卵圆形的被染成深黄色的细胞核，细胞质染成浅黄色，均匀地分布于细胞核与细胞膜之间（图3）图3.口腔粘膜上皮细胞（400×）3.人血涂片标本的观察将血涂片标本放于显微镜下，先用低倍镜浏览整张血涂片，选择细胞均匀分布、较少重叠、有核细胞较多的区域。然后转换高倍镜仔细观察红细胞和白细胞。人血涂片上红细胞数目最多、体积小、呈双凹盘状，无细胞核（图4）。细胞质呈粉红色；白细胞比例较少，寻找较困难，但细胞体积较大，细胞核明显，形态多样，呈紫蓝色。10图4.人血细胞（400×）4.蛙血涂片标本观察显微镜观察可见蛙红细胞为椭圆形，细胞质浅红色，细胞核呈椭圆形；白细胞数目较少，为圆形（图5）。图5.蟾蜍红细胞（400×）（二）细胞大小测量选一洋葱表皮细胞，测细胞大小（长X宽）及核的大小（直径）选一蛙红细胞，测细胞大小（长X宽）及核的大小（直径）11实验三、死活细胞鉴别及细胞计数1.实验目的（1）练习使用细胞计数板进行细胞计数；（2）掌握台盼蓝染色法进行的死活细胞鉴别。2.实验原理（一）细胞计数原理细胞密度（个/ml）=n/4×1000×稀释倍数n=四大格内的细胞总数（二）台盼蓝染色原理死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是：许多酸性染料不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。比较常用的台酚蓝染色法，原理：细胞损伤或死亡时，由于膜