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免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。关键字：牛血清白蛋白（BSA)抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100μg/次（10-20，20~40μg/ml），每次不超过0.5mL。小鼠腹腔注射以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。兔子可以分别尝试皮下（脚掌）、皮内、耳静脉、肌肉注射实验二：抽血、放血，分离抗血清一、采血小鼠采血（一）、尾部采血：需血量少时可用此方法。将小鼠放在在有开孔的离心管内，显露尾部，将尾端剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。（二）、小鼠睚眦采血：将毛细管折断，使其断口锋利。采血时，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。用毛细管的断口，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.2—0.3ml，大鼠一次可采0.5—0.1ml。家兔的采血（一）、耳静脉抽血：将家兔置于兔固定箱内，对家兔进行耳静脉抽血，此法用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决定加强免疫或放血，与耳静脉注射方式相反。（二）、心脏抽血：家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。（三）、颈动脉放血：家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！！！二、抗血清的分离，保存1、斜置装血液的三角瓶0.5-1h；2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；4、次日：估计分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。实验三：酶免疫吸附试验法（ELISA）测定抗体效价一、ELISA原理酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原),再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。二、实验仪器、材料、试剂仪器：酶标板，酶标仪、保鲜膜、排枪材料：牛血清白蛋白（BSA)——抗原，10μg/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA——待测抗体样品，用PBST从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度HRP标记羊抗小鼠IgG——二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。）试剂：包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO31.59克，NaHCO32.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）0.01MPBS溶液（NaCl8.5g,Na2HPO4.12H2O2.85g或Na2HPO4.2H2O1.13g，KCl0.2g，KH2PO40.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）PBST洗涤液：含0.05%Tween20的0.01M的PBS（pH7.4）底物溶液：TMB（3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）2MH2SO4（市售浓硫酸为18.4M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）三、实验方法和步骤1.加抗原：取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）2.包被抗原：保鲜膜包好，37℃1h或4℃过夜（抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上）3.封闭：甩干后以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次，每孔加入100μl5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。保鲜膜包好，37℃，2h后（封闭的目的：降低背景干扰，避免假阳性），取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体。以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次4.加待测血清：标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔（用PBST稀释，按示意图用单枪加）。37℃，保鲜膜包好，60min后甩干孔内液体5.加二抗：以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次。各孔加入酶标二抗100μl/孔，37℃，保鲜膜包好，45min后，甩干孔内液体6.显色：以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次。加入TMB底物溶液50μL/孔，避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50μl的2M硫酸终止反应7.结果分析在酶标仪上，于450nm处测各孔OD值。阴性无色，OD小于0.1；阳性黄色，3个重复的平均值大于0.2，且为阴性对照OD值的2.0倍。打开“酶免大师”，登录密码“1234”，设置参数，选“终点法检测”，建微板，点击“read”，等待读取各孔OD值，导出。经免疫小鼠123456未免疫家兔789101112A0.2080.1880.1930.040.0470.047B0.1480.1410.1440.0480.0440.044C0.10.0910.0920.0390.0390.039D0.0720.0560.0630.040.0450.039E0.0640.0570.0540.0430.0380.045F0.057O.O540.0520.0430.0410.038G0.0490.0510.0490.0440.0450.035H0.0530.0480.0400.0430.040.04结论：由于实验动物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫还可以，初步判断抗原效价为一价。未免疫家兔的血清测定的OD值很小，说明实验材料没有很大的污染。穿插实验;玻片法—血型鉴定实验材料：1、Ag：受检血样（红细胞悬液）2、Ab：标准抗A血清、标准抗B血清（单克隆抗体，不同于标准A型血清、B型血清）。实验方法和步骤：1、受检抗原（血样）制备：用酒精棉球消毒手指---待干后用无菌5#针刺消毒部位---取一滴血（大绿豆大小）于盛有0.6ml生理盐水的离心管中，混匀。2、加标准诊断血清到受检血样中，血型判定：取干净6孔白瓷盘一块（两人用），三孔先各加一滴血样---前两孔分别加入一滴抗A、抗B鉴定血清---用两根无菌牙签分别对前两孔进行混合，水平摇动---2min后观察结果。实验结果分析