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PCR（RT-qPCR）、、，[1-2]。PCR，，，，[3-4]。（ACT）、3-（GAPDH）、18SrRNA、（EF-1α）、（UBQ）、α（TUA）β（TUB）[5-8]。，，，[9-11]，[12-13]。，，。，，。geNorm、NormFinderBestKeeper，3，3，，3，。1geNorm1.1geNormVandesompele[14]2002PCR，，22，。geNormM，M，，。1V，Vn/Vn+1。V0.15（），Vn/Vn+10.15，n；Vn/Vn+10.15，n+1。1.21.2.1Excel。geNorm，Excel，Excel。Excel“”，“”“”，“”。1.2.2△Ct。Ct（Cyclethreshold）（），CtgeNorm、NormFinderBestKeeper11122*（1，524037；2，）PCR（RT-qPCR）、、，，。，，。geNorm、NormFinderBestKeeper，3，、，3，。；；geNorm；NormFinder；BestKeeperS60A1007-5739（2017）05-0278-04AnalysisMethodofSystematicallyEvaluatingStabilityofReferenceGenesUsinggeNorm，NormFinderandBestKeeperWUJian-yang1HEBing1DUYu-jie1LIWei-cai2WEIYong-zan2*（1BasicEducationCollegeofLingnanNormalUniversity，ZhanjiangGuangdong524037；2KeyLaboratoryofTropicalFruitBiology（MinistryofAgriculture），SouthSubtropicalCropsResearchInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences）AbstractReal-timefluorescentquantitativePCRtechnology（RT-qPCR）isusedforgeneexpressionanalysiswithhighsensitivity，goodrepea-tability，strongspecificity，highthroughput，buttheveracityandreliabilityresultsdependonwhetherselectappropriatereferencegeneornot.However，nouniversallyapplicablereferencegeneswithaninvariantexpressionareavailable.Inordertoobtainaccurateresults，appropriatereferencegenesforRT-qPCRnormalisationmustsystematicallyevaluatethestabilityofcandidatereferencegenespriortousingineachexperimentalsystem.geNorm，NormFinderandBestKeeperareusefulprogramstoidentifyappropriatereferencegenesforRT-qPCRanalysis，butthemethodsforusingthethreesoftwaresweredifferent.Inordertosavethetimetounderstandingthewaytousethemandprovideconvenientfornewresearchers，thisstudydescribedthemethodsofapplication.Keywordsreferencegene；stabilityanalysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper（20163107）；（1630062016009）；（CARS-33）；（2016B01106）；（QL1514）；（QL1116）。（1986-），，，，。：。*2016-12-29201752782ExcelNormFinderCt，△Ct，≥0。1.2.32-△Ct。△Ct，Excel2-△Ct，，geNorm。1.2.4Excel。geNormExcel，ExcelgeNorm。Excel，（2，），1，11，1.2.3。1.2.5。Excel，geNorm，“Loadinputdata”1.2.4Excel，“Calculate”，“Automatedanalysis”，，1（a），M，（H3），MM，，M，2（CYP1Fe-SOD2）。“PrintorSavereport”，“saveoutputtofi”MExcel。“Automatedanalysis”，1（b），V，Vn/Vn+10.15，n；Vn/Vn+10.15，n+1，2，V2/3=0.135＜0.15。“PrintorSavereport”，“saveoutputtofi”Vn/Vn+1Excel。2NormFinder2.1NormFinderClaus[15]2004，geNorm，，，。NormFinder，，[16]。2.22.2.1ExcelNormFinder。Office2003Excel，“”“”，“”“”NormFinder，“”，NormFinderExcel，ExcelNormFinder（2）。2.2.2△Ct。1.2.2。2.2.32-△Ct。1.2.3。2.2.4Excel。NormFinderExcel，ExcelgeNorm。NormFinder，Excel1，1，11，2.2.3。2.2.5。2.2.4Excel“NormFinder”“NormFinder”，，3。“Selectinputdate”，Excel，3，“Go”，M，（Bestgene），4RPL2。：geNorm、NormFinderBestKeeper：a；b。1geNormab2794NormFinder3NormFinder3BestKeeper3.1BestKeeperMichael[17]，1001010。（r）、（SD）（CV），，。、，，，；SD＞1，。，。3.2BestKeeperExcel，CP（crossingpoint）（CPdateinput），。，PCRCP“CPdateinput”，CPRT-qPCR3。CP，BestKeeper（r）、（SD）（CV）。，。4geNorm、NormFinderBestKeeper，SCI，[18]、[19]、[20]、[21]BMCMolecularBiology、JournalofExperimentalBotany、InternationalJournalofMolecularSciences、Planta，[22]FrontiersinPlantScience。geNormNormFinder，RT-qPCRCt，Excel，BestKeeperRT-qPCRCP，CP。geNormExcel，ExcelgeNorm。NormF-inderExcelNormFinderExcel，ExcelNormFinder。BestKeeperBestKeeperExcelCP。3，geNorm，。NormFinder，，1。BestKeeper1001010，。5[1]RANSBOTYNV，REUSCHTBH.Housekeepinggeneselectionforqua-ntitativereal-timePCRassaysintheseagrassZosteramarinasubjectedtoheatstress[J].LimnologyandOceanographyMethods，2006，4（6）：367-373.[2]YOOWG，KIMTI，LIS，etal.ReferencegenesforquantitativeanalysisonClonorchissinensisgeneexpressionbyreal-timePCR[J].ParasitologyResearch，2009，104（2）：321-328.[3]QUACKENBUSHJ.Microarraydatanormalizationandtransformation[J].NatureGenetics，2002，32：496-501.[4]NOLANT，HANDSRE，BUSTINSA.QuantificationofmRNAusingre-altimeRT-PCR[J].NatureProtocols，2006，1（3）：1559-1582.[5]SUZUKIT，HIGGINSPJ，CRAWFORDD.ControlselectionforRNAqu-antitation[J].Biotechniques，2000，29（2）：332-337.[6]BUSTINSA.QuantificationofmRNAusingreal-timereversetransc-riptionPCR（RT-PCR）：trendsandproblems[J].JournalofMolecularEn-docrinology，2002，29（1）：23-29.[7]DHEDAK，HUGGETTJF，BUSTINSA，etal.Validationofhousek-eepinggenesfornormalizingRNAexpressioninreal-timePCR[J].Biote-chniques，2004，37（1）：112-119.[8]KIMBR，NAMHY，KIMSU，etal.Normalizationofreversetransc-riptionquantitative-PCRwithhousekeepinggenesinrice[J].Biotechnol-ogyLetters，2003，25（21）：1869-1872.[9]TONGZG，GAOZH，WANgF，etal.Selectionofreliablereferencege-nesforgeneexpressionstudiesinpeachusingreal-timePCR[J].BMCMolecularBiology，2009，10（1）：1-13.[10]TRONDL，CATHRINEL.Referencegeneselectionforquantitativerea-ltimePCRnormalizationintomatosubjectedtonitrogen，cold，andlightstress[J].AnalyticalBiochemistry，2009，387（2）：238-242.[11]MUKESHJ，AASHIMAN，AKHILESHK，etal.Validationofhouse-keepinggenesasinternalcontrolforstudyinggeneexpressioninricebyquantitativereal-timePCR[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2006，345（2）：646-651.[12]MAR，XUS，ZHAOYC，etal.Selectionandvalidationofappropriatereferencegenesforquantitativereal-timePCRanalysisofgeneexpr-20175280!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!