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动物克隆技术1.概述（动物克隆的发展史）2.动物克隆的原理，方法，步骤3.动物克隆的应用4.动物克隆的前沿发展•“克隆”(clone),是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。•在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。•根据核卵供体的来源不同可分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物两种。1996年第一只成年体细胞克隆羊“多利”诞生1997年一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。1998年两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠2000年曾参与克隆“多利”羊的英国公司培育了第一批克隆猪2001年一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。2002年法国研究人员克隆出兔子。2003年美国科学家推出了一匹克隆骡。爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的爪哇野牛。2004年美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一只克隆猫。这只猫后来成为第一只被卖出的克隆宠物。2005年韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”首条克隆狗-“斯纳皮”•克隆技术得以实现的理论基础在于“细胞的全能性”。•细胞的全能性是指细胞包含个体的全套遗传信息，在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体，只有具备全能性的动物组织细胞，才可用于克隆动物。•1.核供体动物的选择与细胞核的获得。•2.核受体动物的选择与细胞核的移出。•3.供体核的移入及原核的取出。•4.胚泡的体外试管培养。•5.代母的选择与胚泡移入子宫。•6.克隆动物的体内发育与出生。•去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。•卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。•MⅡ期的卵母细胞已经成熟，维持的时间长，并且有较高MPF(促成熟因子maturationpromotingfactor)活性有利于供体细胞核的重编程。•核供体细胞的准备：•在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；•其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。•供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。•细胞核移植：•常用的核移植方法显微注射有两种，即胞质内注射和透明带下注射。•胞质内注射：用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内。•透明带下注射：把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。•细胞融合法。用仙台病毒或PEG介导融合，这种方法效果很不稳定而•细胞融合法。用仙台病毒或PEG介导融合，这种方法效果很不稳定而•激活：•卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。•精子进入带来的Ca2+浓度的上升和随后卵母细胞内Ca2+的周期性波动。二是由与Ca2+浓度上升介导的信号传递，导致MPF的降低。•重组胚的体内或体外培养•经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。•羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。•猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。•大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。•胚胎移植：•重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔•1.胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。•2.体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物的体细胞，叫做体细胞克隆。•1.卵母细胞的去核：细管吸除法，紫外线照射法。•2.供体核的准备和移植：将供体胚胎分成单个卵裂球，每个卵裂球即为供体核。•3.卵裂球与卵子的融合：将卵裂球和去核卵子融为一体，形成单细胞结构。•4.卵子的激活：在正常受精过程中，精子穿过透明带及卵黄膜时，引起卵子内钙离子浓度升高，卵子细胞周期恢复，启动胚胎发育，这一现象称为激活。胚胎克隆时，通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞。•5.克隆胚胎的培养•克隆步骤•体细胞克隆的主要技术程序与胚胎细胞基本克隆相同，主要差别在供体细胞的选择。•随着克隆技术的发展和人们对核质关系认识的深入，自然状态的G0期细胞（如卵丘细胞）和G1期细胞（胎儿成纤维细胞），可直接移入去核卵母细胞中生产克隆胚胎。•S期的细胞核进入受体卵母细胞后会发生碎片化，而M期和G2期容易造成多倍体。G0/G1期细胞的获得常用的方法是靠血清饥饿培养诱导，但长时间的血清饥饿会导致细胞凋亡。胚胎细胞核移植体细胞核移植3.动物克隆的应用动物克隆技术的应用1.克隆技术与转基因技术结合。体细胞核移植技术和转基因技术的结合将对解决人类器官移植来源、医药生产和疾病治疗、生物学基础理论研究等具有非常重要的意义。用基因打靶技术筛选阳性细胞作供核体进行核移植，得到转基因动物。制备转基因克隆动物，进行生物药物生产。2.克隆技术与干细胞技术结合在体细胞克隆动物成功率低的情况下，利用ES细胞进行克隆可以增加成功率。3.利用克隆技术，与干细胞技术结合，开展治疗性克隆可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。4.动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术的缺陷1、存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。成百上千次的实验才成功一次，其中以成体细胞核作核供体问题更为严重。原因：①供体核数量的局限性②受体卵子质量的影响③核质关系的影响：细胞核和细胞质关系不协调是导致核移植效率低的一个重要因素。④操作技术的影响⑤克隆出的动物寿命比正常的动物短：端粒的长度2、体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。原因分析：导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。例如，基因组重新编程的机制尚不清楚。基因印记(imprinting)对核移植后基因组重新编程的影响。3、动物克隆种属及细胞差异的原因造成困难。如果这一问题得以解决，将十分有利于濒危动物的保护。4、细胞质遗传问题5、供体细胞的保存和细胞周期的影响6、克隆动物的连续后代是否会累积突变基因••利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。•显微操作技术是指在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器，控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早起胚胎操作的一种方法•固定针在极体对侧固定卵母细胞，去核微吸管对准极体插入透明带，将极体及部分细胞质吸入管中•吸管拉出时，细胞膜被拉长形成一个桥，吸管脱离透明带，质膜被掐断，挤推出管中极体和细胞质•体外受精形成的8细胞牛胚胎经透明质酸酶处理后分离出8枚分裂球（胚胎细胞）•将胚胎细胞移入去核卵母细胞的透明带中。•中科院上海生科院生化与细胞所李劲松研究组采用了一种被称为四倍体胚胎补偿的技术。四倍体胚胎补偿技术是将四倍体胚胎与二倍体胚胎聚合成一个胚胎，在聚合胚胎的发育过程中，四倍体的细胞绝大部分发育成胚外组织，而胎儿则是由二倍体发育而来。该技术通常用于挽救二倍体胚胎由于胎盘发育缺陷导致的发育失败。那么如果克隆囊胚滋养外胚层的确存在重编程异常细胞，并导致克隆胎儿发育的失败，那么通过四倍体胚胎补偿技术就能够显著提高克隆胎儿的出生效率。•他们先将一个克隆胚胎与两个四倍体胚胎聚合在一起，发现聚合胚胎的出生率提高了2.6倍。这说明当克隆滋养外胚层嵌入具有正常功能的四倍体细胞后，克隆胎儿的发育率得到了明显的改善。但异常的克隆滋养外胚层细胞仍然存在于胚外组织中，会对胎儿的发育产生不利的影响。因此，他们预测将克隆囊胚的滋养外胚层细胞全部替换成四倍体细胞会进一步提高克隆动物的出生率。•为此，他们采用免疫手术法去掉克隆囊胚的滋养外胚层细胞，然后将分离出来的内细胞团细胞与两个四倍体胚胎进行聚合，结果发现克隆动物的出生率提高了6倍。•最后，他们又做了一个相反的实验，即将正常囊胚的内细胞团细胞与两个克隆来源的四倍体胚胎进行聚合，发现出生率与直接核移植后的克隆小鼠出生率相似。这些结果充分证明了克隆囊胚的滋养外胚层中存在重编程异常细胞并影响胎儿的发育。这一结果对核移植研究领域的发展具有重要的意义。