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牛冻精精子活力检测方法的建立学生姓名：李梦婷指导教师：张贵学教授合作指导教师：许红喜助理研究员所在院系：动物科学技术学院所学专业：动物科学研究方向：动物繁殖立题依据1研究现状2材料与方法3数据分析与结论4致谢5论文的结构和主要内容立题依据及研究现状•精液品质的好坏，直接影响到母牛的受胎率，从而影响畜牧业生产的经济效益。因此，在采集的鲜精液的处理和冻精制作过程中，必须对冷冻后的精液品质进行全面检查和鉴定。国家规定每计量冷冻精液解冻后，精子活力至少要大于35%，前进运动精子数至少大于800万个，精子畸形率要小于18%，细菌数小于800个，这样的细管冻精才能用于母畜的繁殖生产和科学研究。对于解冻后的冷冻精液保存一段时间后，用前一定要进行品质检测。本文做了两方面的实验研究：对解冻后的精液密度、活力、细菌数检测的实验研究，建立了完整的检测方法。检测了12头种公牛的原精，2头不符合标准而废弃。设计了37℃及冰水两种环境对解冻后的冷冻精液进行保存,检查菌落数及精子活力,以观察两种保存环境对精液品质的不同影响,为生产提供可应用的操作方法。由结果可以看出,精液保存在冰水或37℃的环境中,菌落数没有明显的变化,均在国标范围内(菌落数低于800个)，所以时间及时间与温度互作对精液品质没有明显的影响,但温度对精液品质具有显著的影响。材料与方法•实验材料：•细管冷冻精液来自博瑞遗传有限公司生产基地。每头牛取0.25mL细管冻精14支,要求是同一批次生产的冻精,共12头牛的精液。•显微镜、载玻片、蒸馏水、姬姆萨染料、甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇、甘油、血球计数室、3.0%氯化钠溶液•实验方法：•先取两支冷冻细管检查精子活力、畸形率、密度和菌落数,用合格的精液进行后续试验。•12支细管冻精分成两组,每组6支,一组检查活力,一组做细菌培养以检查菌落数。精子的畸形率精子活力及密度冷冻精液检查培养的菌落项目细管壁与两端封口剂量（ml）精子活力呈直线运动的精子数37℃保存4h的活力（%）顶体完整率（%）畸形率（%）细菌菌落数（个）国家标准GB4143-84无裂痕、严密0.25±0.01≥35≥1×107≥5≥40.0≤18.0＜500第1头符合标准0.25371.23×107547.315.225第2头符合标准0.25351.23×108547.212.524第3头符合标准0.25361.43×107547.716.140第4头符合标准0.25351.45×117547.112.834第5头符合标准0.25361.43×1175.248.513.533第6头符合标准0.25381.35×1175.250.312.724第7头符合标准0.25371.38×1175.146.313.224第8头符合标准0.25351.23×117544.315.526第9头符合标准0.25361.28×117548.514.327第10头符合标准0.25351.26×117547.315.527第11头符合标准0.25301.33×106337.222.560第12头符合标准0.25281.21×116232.331.580牛冻精品质检查结果由结果可以看出：第11和第12头牛的冷冻精液不符合标准而废弃，所以只用十只牛的冷冻精液做后面的实验。•活力检查：•6支冻精全部解冻,分成两组,一组置37℃恒温箱中,另一组置于冰水混合物中。开始计时,分别于0.5h、2h、4h后检查精液活力。•细菌培养：•采取倒计时的方法解冻,4h、2h、0.5h分别解冻2支细管,1支置于37℃恒温箱中,另一支置于冰水混合物。精液分别接种于培养皿中,在37℃恒温箱中培养48h,统计菌落数。活力的检查置于冰水混合物中解冻0.5小时后的精子活力置于冰水混合物中解冻4小时后的精子活力细菌的培养置于冰水混合物中解冻0.5小时培养的菌落数置于恒温箱中解冻0.5小时培养的菌落数不同保存温度和时间精子活力和菌落数的变化牛序号123456789100h活力0.570.550.560.550.560.580.570.550.550.55菌落23131231120.5h冰水菌落5565575555活力0.570.550.560.550.560.570.570.550.550.55常温菌落7575675555活力0.560.550.560.550.560.570.570.550.550.552h冰水菌落7655575556活力0.560.550.550.550.560.560.560.550.550.55常温菌落7676676655活力0.520.500.520.520.520.540.520.520.530.524h冰水菌落5554555545活力0.560.550.550.550.550.560.560.550.550.55常温菌落6665676757活力0.300.320.340.350.300.320.310.300.300.30由结果可以看出,精液保存在冰水或37℃的环境中,菌落数没有明显的变化,均在国标范围内(菌落数低于1000个)。结果表明,时间及时间与温度互作对精液品质没有明显的影响,温度对精液品质具有显著的影响。0.5h的时候,保存在冰水以及37℃的精子活力没有明显差异,精子的活力均在合格范围内。在4h以后就出现了显著差异,在37℃环境中的精子活力明显降低了,低于0.35的国家标准,而冰水中的精子活力没有明显的变化。所以冷冻精液为了保证良好的品质，最好在解冻两小时以内做实验或生产。致谢•大学四年的学习生活即将结束。在此，我要感谢所有曾经教导过我的老师和关心过我的同学，他们在我四年的成长过程中给予了很大的帮助。本文能够顺利完成，要特别感谢我的导师张贵学教授，并且感谢农垦科学院的领导和研究员给予我的关心和帮助。•最后向所有关心和帮助过我的人表示真心的感谢。