食品中微生物标准检验与分析技术

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析一、菌落总数介绍食品验样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g)验样中形成菌落的总数。国家标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析●食品污染程度的标志●预测食品存放的期限卫生学意义二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每mL）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释----倾注平皿----培养48小时----计数报告。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析三、检验程序GB/T4789.2-2003第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析四、操作步骤（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称数量1、500mL广口瓶1个2、500mL三角瓶1个3、250mL三角瓶2个4、18×180mm试管3支5、1mL移液管5支6、直径为90mm平皿10套7、250mL量筒1支8、玻璃珠：直径约5mm9、剪刀1把不锈钢药匙1把第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析样品：袋装鲜奶1．操作方法用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25mL，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入，振摇均匀，即为1:10的稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释1．操作方法根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释（四）菌落计数1、计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。2、若所有稀释度均不在计数区间，如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。（四）菌落计数第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析3、不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。4、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。（四）菌落计数第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析（四）菌落计数第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析5、当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数五、菌落数报告按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。报告方式以下表为例（四）菌落计数第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数的检验与分析第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析大肠菌群是指一群在37℃培养24小时能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析第二节大肠菌群的检验与分析检测步骤1、检样稀释MPN：表示食品中大肠菌群数是以每100mL或克检样内大肠菌群最近似值，一般采用9管法。一般样品25mL（克）+225mL生理盐水=1：10，从此10-1取样10mL，则其中含样品为1mL（克）。接种到3管双料乳糖发酵管中。从此10-1取样1mL，则其中含样品为0.1mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。表142—143。从10-1取样1mL+9mL生理盐水=1：100，从10-2取样1mL，则其中含样品为0.01mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析2、乳糖发酵试验（1）培养基单料乳糖胆盐发酵管：蛋白胨2%猪胆盐（或牛胆盐）0.5%乳糖1%、1.6%溴甲酚紫酒精液0.06mlpH7.4。制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外其他成分加倍。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析（2）原理溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群。胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。分解乳糖产酸产气的大肠菌群，看小倒管中的气体。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析杜氏发酵管产气情况1产气2不产气第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析鉴别培养基名称加入化学物质微生物代谢产物培养基特征性变化主要用途H2S试验培养基糖发酵培养基伊红美蓝培养基醋酸铅溴甲酚紫伊红、美蓝H2S乳酸、醋酸、丙酸等酸产生黑色沉淀由紫色变成黄色带金属光泽深紫色菌落鉴别产H2S菌株鉴别肠道细菌鉴别大肠菌群3、鉴别和分离培养第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析4、证实试验（1）革兰氏染色：阴性、短杆菌（2）乳糖复发酵：产酸产气第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析粪大肠菌群的检验检验的稀释乳糖发酵试验证实证验（EC肉汤发酵伊红美蓝培养基）结果评定第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.ColiBroth）第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析第一个半天器材准备准备器材并灭菌，如下：1、250mL三角瓶1个2、18×180mm试管2支3、乳糖发酵管（带黑帽或棉塞，有刻度试管，内带小倒管）15支4、250mL量筒1支5、1mL移液管2支6、10mL移液管2支7、平皿6套第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析第二个半天样品处理及初发酵1、样品处理2、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验3、培养18—26小时，于35—37摄氏度第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析第二天伊红美蓝培养基分离培养[接种EC肉汤（粪大肠菌群）1、伊红美蓝培养基分离培养2、接种EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.ColiBroth）第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析伊红Y是一种酸性染料,有色部分为阴离子(E-)美蓝是一种碱性染料,有色部分是阳离子(M+)。细菌细胞的主要成分是蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,在偏酸性环境中正电荷增多,易与伊红结合,在碱性环境中负电荷增多,易与美蓝结合。而细菌发酵乳糖是产酸的.美蓝并不是完全不起作用，多见于典型的大肠杆菌(乳糖发酵很迅速),在伊红染成粉红色之后,美蓝可以继续将其染成紫黑色带金属光泽的菌落。第三天证实试验1、乳糖复发酵试验2、从阳性EC肉汤接种EMB分离培养。3、EMB典型菌落革兰氏染色镜检第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析革兰氏染色：阴性、短杆菌第四天观察结果与器材消毒与清洗1、观察乳糖发酵管结果2、观察EMB培养结果并革兰氏染色镜检3、器材消毒与清洗4、查表报告结果与撰写实验报告第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群的检验与分析第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。一、沙门氏菌生物学特性第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。1、沙门氏杆菌简介第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。已发现的近一千种（或菌株）。按其抗原成分，沙门氏菌可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。1、沙门氏杆菌简介第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析形态、染色G-杆菌0.6-1.0um×2-4um周身鞭毛，有菌毛。沙门氏杆菌的形态大小第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析生化反应不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌的检验与分析沙门菌病目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。肠热症----是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎（食物中毒）----是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。败血症----常由猪霍乱杆菌、丙型副伤