新手Western-blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项【原理】WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。【试剂及配制】1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。2、电泳缓冲液Tris（分子量121.14）3.03g甘氨酸（分子量75.07）18.77gSDS1g蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。3、转膜缓冲液湿转法48mmol/LTris2.375g39mmol/L甘氨酸11.25g0.0375%SDS0.375g加少部分蒸馏水溶解20%甲醇200ml蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。4、TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mlNaCl8.8g蒸馏水定容至1000ml配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。5、TBST缓冲液（洗膜液）20%Tween201.65mlTBS700ml混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。6、封闭液脱脂奶粉5gTBST100ml【蛋白质样品制备】具体步骤参考RIPA试剂盒的说明书。蛋白质的样品制备是WesternBlotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:（1）为防止蛋白质在样品处理过程中出现细胞破碎所致酶类修饰和蛋白降解，制备过程应在冰上操作，并加入合适的酶抑制剂。（2）样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存于-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。（3）若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外loadingbuffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loadingbuffer混合均匀。（4）为确保蛋白浓度在合适范围内，应注意加入裂解液的量，适度稀释蛋白。【蛋白质定量】具体步骤参考BCA试剂盒说明书。BCA定量测吸光度后，用EXCEL作曲线，计算出不同样品蛋白含量（或大致估算出蛋白含量），再加入适量体积的loadingbuffer稀释样品至一定浓度（以确保等体积上样时不同样品蛋白质含量相似），上样前需将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用加热器加至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。之后样品可在4℃冰箱内短期保存或在-20℃冰箱内保存半个月至一个月，应避免反复冻融。【SDS-PAGE电泳】1.清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干（为省时间也可用吹风机吹干)。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，用保鲜膜包裹玻璃板封存。梳子应用自来水洗干净后再用蒸馏水冲洗，临用前（用无水乙醇擦拭）晾干。2.灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹板固定卡紧（两块玻璃板的下缘不可有错位缝隙，若有明显的缝隙可能会导致漏胶）。然后放置于做制胶器上根据玻璃板间隙宽度选择压的程度并准备灌胶（操作前建议先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，试剂中AP和TEMED是促凝剂，在最后顺序加入，之后用1ml枪吹吸摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。分离胶加至小玻板2/3宽处，大约在插入梳子的下缘1cm处，然后立即在胶上加水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。③当水和胶之间有一条折射线时（或配胶后管内剩余的分离胶差不多凝了），说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用移液枪或吸水纸将水吸干。聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在10min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过30min，若超过30min甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。由于TEMED催化AP释放相关化学基团，再由AP释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果AP不新鲜的话加再多的TEMED效果也不佳，故已配制好的AP一般分装并-20℃保存。④按说明书配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，如果液面上有气泡，则继续缓慢加浓缩胶使液面逸出同时将枪头朝一个方向将液面上方的气泡刮向角落，刮去气泡后将梳子插入浓缩胶中。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡产生，可先将梳子接触到液面，使其润湿，再插入，同时注意要水平插入。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。⑤趁浓缩胶聚合的时间里或在之前，可将样品从-20℃中取出置于-4℃解冻，若样品长时间未使用，加样时注意混匀。⑥待到浓缩胶凝固后，往两胶间的内槽中加电泳液使其没过加样孔，之后两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，即可开始加样。加样前可用5ml注射器先冲洗一下加样孔，避免有碎胶等杂物存在于加样孔；若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。一般在第一个孔加入marker，之后用适当量程的移液枪吸取适量样品加入所需加样的孔内，注意加样时从孔的上方缓慢伸入液面下孔内，用枪头时注意不要插得太用力太深，否则容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了，此外加样时不要过快避免样品被冲出加样孔。⑦浓缩胶配好后也可先不加样，保鲜膜封好后于4℃保存，1~3天内使用。3、电泳从制胶器上取下凝好的胶板，将胶板置入电泳槽中，加入电泳液，注意电泳槽内的电泳液不要加太满，应低于内槽里的电泳液面水平2cm左右。电泳时间和电压没有标准，按照实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。当电泳至marker及样品被压成一条直线并即将进入分离胶或marker有分离趋势时即可转换电压，电泳至溴酚蓝刚跑出或即将跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接转膜。电泳时可将电泳槽至于冰水中浸泡，避免电泳时温度过热影响目前转换电压：80V转至120V。时间不确定。【湿法转膜】1、在电泳结束前20min左右开始准备转膜所需要的东西。先准备一个托盘，在其内倒入适量转移缓冲液，随后将电泳槽夹板、海绵放入其中浸泡，同时准备好洁净的培养皿（或其它容器）。2、为了防止在没有电场的情况下蛋白条带的扩散，转膜操作要尽快。3、取出玻璃板，用硬卡片将玻璃板撬开，翘的时候动作要适度力度适中，注意玻板比较脆弱。撬开玻板后，将浓缩胶轻轻刮去，避免刮破分离胶，随后按照需要切胶（为避免胶干可加些转移缓冲液在胶上），保留下需要的部分（表面一般为长方形），用尺子量出长宽并记录，随后将膜放入托盘内。按照长宽剪取两块厚滤纸和一块PVDF膜（先剪好两块滤纸，再根据滤纸大小剪膜，使膜比滤纸稍微大一点点，避免转膜时滤纸过大相互接触而引起短路）。滤纸剪好后，放入托盘内转移缓冲液中泡10min左右；膜剪好后，放入盛有甲醇的培养皿中泡1~2min（活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白质结合），随后将膜转入盛有蒸馏水的培养皿中泡至其沉底（3min左右），最后将膜放入盛有转移缓冲液的培养皿中浸泡待用。4、打开夹板，将夹板的黑色面（代表阴极）朝下放置，在黑色面上放置一块海绵，再将一块滤纸放在海绵上，随后将胶小心铺在滤纸上，用硬卡片轻轻刮一刮赶气泡，随后镊子夹取PVDF膜铺在胶上，硬卡片刮一刮，之后再铺一层滤纸，最后铺上一层海绵，将夹板阳极透明面盖上夹紧（注意铺完最后一块海绵时不能使滤纸胶膜的相对位置移动，若有移动则需重新操作）（形成阴极黑色面—海绵—厚滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—阳极透明面层次，注意赶气泡，注意阴阳极），随后插入电泳槽中。滤纸在浸泡后容易胀大，若大于膜，则需用剪刀再做修整，此外，铺滤纸之前可捏一捏滤纸，确保滤纸全部被浸透而无气泡。将膜铺于胶上时，为避免产生气泡，可通过多加转移缓冲液使胶被浸没（或者镊子夹住膜的一端，使膜与胶呈一定夹角缓慢放置）。5、将夹板固定好后插入电泳槽内，向电泳槽中加转移缓冲液，转移缓冲液应浸没夹板，盖好电泳槽盖子，随后将电泳槽置于冰水中浸泡即可开始转膜。转膜条件：电流200mA时间1h20min（电压适当调高些，否则无法达到电流200mA的条件），时间可依据蛋白分子量大小及转膜情况做适当调整。【免疫杂交反应及显影】1、预先准备盛有TBST的平皿，转膜结束后，取出PVDF膜，在靠近marker的一侧上方或下方剪一个小三角，以区分膜的正反面（以贴近胶的那一面称为膜的正面），同时注意镊子夹取膜的时候尽量夹膜的边角。若未见marker条带，可将膜在20%甲醇中泡一下，随后对着白透射光线看，若蛋白转在膜上则可依稀看到透明的蛋白条带，用于观察电泳效果和转膜效果。2、将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中，摇床摇洗3次，每次5min，转速80r/min。3、随后将膜夹入盛有封闭液的平皿内，此时可将膜的正面朝上，摇床摇动封闭2h，转速80r/min（封闭是为了封闭膜上的蛋白吸附位置，这样抗体才能够特异结合到目的蛋白上）。4、封闭完毕后，将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中，摇床摇洗2次，每次5min，转速80r/min。5、摇洗后，将膜正面朝下置于盛有一抗的一抗孵育盒中（若一抗足够最好正面朝上），摇床震荡孵育15min（80r/min），随即放入4℃冰箱中静置过夜孵育。6、一抗过夜孵育后，将膜正面朝下置于盛有PBST的平皿中（注意及时回收一抗），摇床摇洗3次，每次5min，转速80r/min。7、随后将膜正面朝下置于盛有二抗的二抗孵育盒中（若二抗足够最好正面朝上），摇床震荡孵育1h（80r/min），8、二抗孵育完毕后，将膜正面朝下夹入盛有PBST的平皿中（注意及时回收二抗），摇床摇洗3次，每次5min，转速80r/min。一二抗孵育时如一个槽内有两条膜，最好反面相对孵育，不建议3条及以上的膜在一个槽内孵育。注意一抗二抗的回收。9、在摇洗二抗的同时，按照显影液试剂盒说明书配置显影液（于锡箔纸包裹的EP管中），待摇洗完毕后即可显影，显影前备好无手指套PE手套一只、200微升移液枪一把、枪头一个、弯镊子一把、滤纸片若干条。显影时切记膜要正面朝上，且不可有气泡，为避免气泡产生，可用镊子夹住膜的一端，使膜与胶呈一定夹角缓慢放置。10、孵育抗体前建议将膜的一条边轻触卫生纸或滤纸上以吸去膜上多余的缓冲液，避免抗体被额外稀释，此外，特别注意不要让膜干了，否则会影响显影结果。