疫苗佐剂综述

疫苗佐剂综述近三十年来，人用疫苗佐剂发展迅速，已经研发出了能诱发更强，更持久的人用疫苗佐剂。但是还存在一些不足之处，理想的疫苗佐剂应该更适于临床应用，毒副作用更小。本文总结了当前疫苗佐剂的发展状况，其中包括疫苗佐剂的监管建议，理想佐剂的标准，以及详细介绍了诸如矿物盐类佐剂，毒素类佐剂，微生物衍生物类佐剂，油乳剂，细胞因子佐剂，多糖类佐剂，以及核酸佐剂。同时本文还讨论了最近新发现的Toll样受体的生物学作用以及在免疫激活中发挥的作用。关键词：疫苗；佐剂；Toll样受体；1引言免疫接种的目的就是要获得对疾病持久的免疫保护反应。与弱毒疫苗不同，灭活疫苗或亚单位疫苗通需要疫苗佐剂的参与才能更好的发挥作用【1】。“佐剂”一次来自于拉丁语“Adjuvare”一词，为“帮助”或“辅助”之意【2】。免疫佐剂的生物作用包括：（1）抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；（2）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。人们正是因为观察到疫苗接种位点处形成的脓肿协助机体产生了针对特异性抗原更强的免疫反应，从而形成了疫苗佐剂的理念。更有甚，与接种抗原不相关的物质形成的脓肿坏死也能增强疫苗的特异性免疫反应【3,4】。1926年，通过吸附于铝盐类化合物的白喉类毒素首次证明了铝盐类佐剂的免疫增强作用。至今，铝盐类佐剂（主要指氢氧化铝和磷酸铝）依然是唯一人用疫苗佐剂。其原因是什么呢？尽管大量事实证明，弗氏完全佐剂和脂多糖类佐剂具有更强的佐剂活性，但由于其能引发局部和全身性的毒副作用而不适于人用。这也正是铝盐类佐剂作为人用疫苗佐剂80余年的原因所在。在今后的80年中，铝盐是否依然是人用的唯一疫苗佐剂？答案是肯定的。自批准铝盐作为人用疫苗佐剂以后，管理部门对人用疫苗佐剂的要求提高了很多。而且，用于评价疫苗佐剂安全性的后期临床试验花费日益昂贵。一旦通过200至500人安全性和效用性实验后，在疫苗佐剂审批注册之前还需要进行5000至25000人数的临床试验。正因为如此，在接下来的10至20年之间，几乎没有哪种佐剂能通过疫苗佐剂审批。2理想的疫苗佐剂免疫接种时需要考虑以下几点：抗原种类，接种动物种类，免疫途径，以及可能产生的免疫副作用【10,11】。理想的佐剂半衰期长，生物体内可以降解，生产成本低，能诱导产生合适的免疫反应（也就是根据感染病原的不同，产生相应的细胞免疫和体液免疫）【12】。不同的接种途径能明显影响到疫苗佐剂的免疫效果，诸如粘膜免疫和非肠道途径。因此，新型疫苗载体，抗原递呈系统和佐剂复合物不都必须考虑带疫苗接种的最适途径【13】。虽然皮内和皮下疫苗接种与肌肉接种更能刺激机体的免疫反应，但由于铝盐佐剂剧烈的局部副作用，使其只能进行肌肉注射途径接种。疫苗佐剂与抗原的混合使用需要权衡不良反应和免疫效应之间的关系。局部反应主要包括疼痛，局部炎症，肿胀，溃疡，接种部位细胞坏死，以及无菌性脓肿的形成。全身反应主要有恶心，发热，佐剂性关节炎，葡萄膜炎，变态反应，器官特异性毒性，以及免疫毒性（如，细胞因子释放，免疫抑制，自身免疫疾病）【16,17】。但是，通常疫苗佐剂的免疫效应通常与毒性成正相关，其中弗氏完全佐剂就是很明显的例子。因此，减小疫苗佐剂的毒性依然是佐剂研发道路上的巨大障碍。3佐剂发展道路上的规章障碍对人用疫苗佐剂的要求远比兽用疫苗佐剂苛刻。除了要进行临床前期佐剂本身的研究外，在进入临川一期试验前还需要进行抗原和佐剂混合后的毒物学评估。前期临床毒物学评估通常使用小动物，如老鼠，小白鼠，兔子。使用与人类相同的免疫接种途径，相同的接种剂量和接种次数，或者更高的剂量来评估佐剂是否存在潜在的毒性【19,20】。疫苗佐剂审批中最大的障碍在与需要很大数量的试验对象进行新型疫苗佐剂或疫苗效用以及安全性的评估。而且今年来所需要试验对象的数量剧烈的增加了，以免因为试验对象数量的不足致使不能对临床药物进行客观公正的评估。4疫苗佐剂分类4.1矿物盐类佐剂铝盐类（主要指氢氧化铝和磷酸铝）至今一直是人类使用最广泛的疫苗佐剂【16】。然后，铝盐类佐剂在某些情况下不能诱导很强的免疫反应，特别是不能诱导细胞免疫反应【23-25】。虽然有文献指出铝盐类佐剂的作用机理是在接种位点形成抗原贮存库而发挥佐剂作用，但是其具体的作用机制当前还不明确【26】。其作用机制也可能包括补体激活，嗜酸性粒细胞或吞噬细胞的激活【27】。铝盐类佐剂皮下或皮内接种时通常形成肉芽肿，而肌肉注射接种途径则不形成【28-30】。铝盐佐剂也能增加IgE的产生，变态反应，以及潜在的神经毒性。4.2皂苷类佐剂QuilA是来源于巴拿马皂树皮的提取液中，通过反向色谱层析技术分离的QS-21能诱导机体针对HIV-1以及其他病原抗原产生强烈的细胞免疫反应【16,37,38】。QuilA是由23中不同的皂角苷组成的天然产物，由于其强烈的毒性作用而不适于人类使用。不仅能引起剧烈的局部反应和肉芽肿，还能引起红细胞溶解反应【14,39-42】。与QuilA相比QS-21毒性相对较小，但是依然不适合人类使用，除非是能接受其毒性的癌症疫苗或者相对小剂量的使用才可以。4.3微生物衍生物类佐剂由于细菌和真菌中的一些成分能很好的刺激机体发生免疫反应，所以其能成为潜在的疫苗佐剂。细菌细胞壁的肽聚糖和LPS能很好的增强免疫反应，但不能对其本身产生免疫反应。此类佐剂是通过激活的Toll样受体介导的，机体接受到危险信号时Toll样受体激活全身的防御反应。完整的灭活菌体由于其巨大的毒性作用而不适于作为人用疫苗佐剂，但是研究发现，发挥作用的成分主要是胞壁酰二肽（MDP）【44】。盐溶液中MDP主要增强体液免疫反应【14,45,46】。但当与脂质体或甘油共同使用时却能激发很强的细胞免疫反应【47】。另一种细菌衍生物类佐剂主要是革兰氏阴性菌的LPS。LPS中具有佐剂活性的结构成分主要是脂质A。弱酸性条件下，脂质A能水解为单磷酰脂A（MPL），MPL能保持脂质体A的佐剂效应，同时降低其毒性反应【49】。另一种具有佐剂活性的细胞壁衍生物为海藻糖二霉菌酸酯（TDM），此种佐剂能同时激活细胞和体液免疫反应【50】。4.4油乳剂佐剂此类佐剂包括水包油或油包水乳剂，如，弗氏不完全佐剂，Montanide系列，佐剂65。通过在接种位点形成抗原贮存库降低抗原的释放速度，以及刺激产生抗体的浆细胞发挥佐剂效应。通常情况下，由于一些佐剂的毒性使其不适于人预防用疫苗的使用，但在极端情况下却可以使用，例如发生癌症时机体对佐剂的毒性具有很大的耐受性。通常油乳剂的副作用主要包括在接种位点处形成炎症反应，肉芽肿以及溃疡。为了筛选出更稳定，毒性更小的油乳剂，已经对不同来源的多种天然油进行了评估。水包油和油包水疫苗佐剂是继弗氏不完全佐剂发展起来的油乳佐剂，更加稳定，毒副作用也更小，并易于进行质量监控【58,59】。Montanide系列疫苗佐剂已经进行了HIV，疟疾，以及乳腺癌疫苗的研究【60】。4.5微粒抗原递呈系统与抗原的贮存效应协同，在免疫反应中微粒的性质决定抗原递呈系统是否能被成功激活。如果抗原递呈系统被激活，则疫苗的化学成分决定产生何种免疫反应【61】。研究透彻的微粒抗原递呈系统主要包括：脂质体，多聚微球体，纳米粒子，免疫刺激复合物，病毒样粒子。这些是很重要的抗原递呈系统。此类疫苗佐剂广泛地作为蛋白亚单位疫苗，DNA疫苗的载体。当前主要的研究热点在于阐述微粒的大小和化学性质与佐剂的相互生物作用和机制之间的关系。4.6细胞因子佐剂一般来说，细胞因子划分为现代疫苗佐剂。例如，粒细胞巨噬细胞刺激因子通过激活和招募抗原递呈细胞来增强初始免疫反应【87】。然而，由于粒细胞巨噬细胞刺激因子需要多次使用，具有毒性，以及一种细胞因子的免疫反应，使其实际应用是受到很大的限制【11】。DNA疫苗中，当细胞因子与抗原共表达于同一载体时能发挥很强的佐剂效应【88】。另外，IL-12以及其他细胞因子可溶性蛋白直接作为粘膜免疫佐剂时也能发挥很大的作用。4.7多糖类佐剂来源于菊科植物根部的碳水化合物菊粉形成微粒时，能诱导强烈的体液和细胞免疫反应。菊粉微粒（MPI）是强有力的替代补体途径的激活剂，因此能激活先天性免疫反应【91】。与Montanide和QS21相比，MPI在刺激细胞免疫的同时也不会引起毒性反应。MPI与其他佐剂联合使用时形成了预期的疫苗佐剂，能不同程度的激活Th1和Th2细胞活性。MPI能很容易的诱导Th1和Th2免疫反应，并且不会产生IgE，没有明显的局部和全身性的毒性反应【94】。菊粉在体内代谢产物为单糖果糖和葡萄糖，因此不会有铝盐类佐剂那样的副作用。4.8佐剂剂型新型疫苗佐剂是两种或多种具有不同作用机制的佐剂混合物。此种策略的主要目的在于进一步增强或调节针对特定抗原的免疫反应。已经开发出MPL和铝盐类佐剂的联合佐剂用于乙肝疫苗，用于具有肾病的乙肝患者。在这些高危群体中，此类佐剂疫苗免疫反应产生的更快，更强烈，更持久，并且局部免疫反应轻微【108】。AS04佐剂已经评估用于HPV疫苗的研制【109,110】。4.10TLRs和佐剂活性前面已经提到，Toll样受体激活剂已经作为疫苗佐剂激发机体的免疫反应。Toll样受体是哺乳动物免疫系统细胞表达的跨膜信号蛋白，与其结合的配体必须具有高度的特异性【115】。这些配体都是进化特征明显的病原相关分子模式。Toll样受体由于其主要分布单核或巨噬细胞、树突状细胞，已经作为疫苗研究的基础策略。TLRs受到过度刺激时也会产生诸如弗氏完全佐剂之类的毒副作用。因此，必须考虑佐剂的剂量，作用机制，而不单单是佐剂的免疫效果。5.未来五年发展趋势尽管近几十年来免疫学方面的知识不断的加深，但是铝盐类佐剂依然是当前人用疫苗的主要佐剂。并且此种局面在以后几年内也不会有所改变，因为已经研制出的疫苗效果挺好，并且对于儿科预防用疫苗来说，安全性是首要考虑的一点。然而，HIV,丙肝，疟疾以及其他顽疾的新型重组亚单位抗原，合成抗原则需要引进新型的临床试验用疫苗佐剂。对佐剂作用机制的研究有助于进一步阐述佐剂活性背后的分子相互作用，同时，生物信息学的发展也进一步增强了致力于新型佐剂研究的科学家的预测能力。参考文献：[1]PetrovskyN,AguilarJC.Vaccineadjuvants:currentstateandfuturetrends.ImmunolCellBiol2004;82(5):488–96.[2]VogelFR.Adjuvantsinperspective.In:BrownF,HaaheimLR,editors.Modulationoftheimmuneresponsetovaccineantigens.Dev.Biol.Stand.vol92.Basel:Karger;1998.p.241–8.[3]RamonG.Surl’augmentationanormaledel’antitoxinechezleschevauxproducteursdeserumantidiphterique.BullSocCentrMedVet1925;101:227–34.[4]RamonG.Procedespouraccro¨ıtrelaproductiondesantitoxins.AnnInstPasteur1926;40:1–10.[5]GlennyAT,PopeCG,WaddingtonH,WallaceV.Theantigenicvalueoftoxoidprecipitatedbypotassium-alum.JPathBact1926;29:38–45.[6]VogelFR,PowellMF.A