达托霉素的HPLC的方法学研究

宜顺论文网摘要建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。方法以达托霉素和一些杂质为对照品，采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件为色谱柱：PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm，流速：1.0ml/min，检测波长：223nm，进样量：25µl，柱温：25℃，梯度洗脱的流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调pH至3.1，流动相B：乙腈。结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。[关键词]含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性宜顺论文网一、仪器与药品..............................................5二、方法建立与方法描述.....................................5(一)、方法建立...................................................5（二）、方法描述.................................................5三、验证内容...............................................7（一）系统适应性..................................................7（二）降解实验....................................................8（三）专属性......................................................8（四）定量限LOQ和检测限LOD.......................................9（五）线性.......................................................12（六）相对校正因子的计算.........................................18（七）精密度....................................................18（八）准确度.....................................................23（九）溶液稳定性.................................................26（十）耐用性.....................................................28四、结论..................................................29五、典型图谱..............................................30六、参考文献..............................................30宜顺论文网一、仪器与药品电子分析天平XP205已校正高效液相色谱仪Agilent1200已校正磷酸二氢铵分析纯上海光铧科技有限公司20121215乙腈色谱纯MerckUN1648注射用水每日更新本厂自制纯化水每日更新本厂自制达托霉素对照品P1301，94.7%本实验室内部标定水解物P1301，91.4%本实验室内部标定β-异构体P1301，71.9%本实验室内部标定脱水物P1301，86.6%本实验室内部标定达托霉素样品S130301浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述（一）、方法建立袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测，在190nm～360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm色谱柱。（二）、方法描述[含量]色谱柱：PhenomenexIB-SILC84.6×250mm5µm流速：1.0ml/min检测波长：223nm进样量：25µl宜顺论文网柱温：25℃进样器温度：2~8℃流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1流动相B：乙腈流动相：梯度洗脱A(%)B(%)067.532.54560405050505550505667.532.56067.532.5稀释剂：注射用水标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量：湿计含量%=ru×Cs×P×100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml）rs是标准溶液所对应的主峰峰面积ru为样品溶液所对应的主峰峰面积P为对照品的含量，%无水无残溶含量计算公式：干计含量%=湿计含量%1-水分%-残溶%限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。[有关物质]色谱条件和样品溶液同含量。1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。宜顺论文网用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量：含量%=ru×Cs×P×100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度（mg/ml）rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值P为对照品的含量，%限度：脱水达托霉素≤1.5%，β异构体杂质≤0.7%，水解物≤0.4%，杂质1（RRT约为0.79）≤0.2%，杂质2（RRT约为0.92）≤0.2%，杂质3（RRT约为0.94）(C9)≤0.6%，杂质4（RRT约为0.96）≤0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11）≤0.7%，杂质6组（RRT约为1.20～1.25）≤0.6%单个未知杂质≤0.1%，总杂质≤5.0%三、验证内容（一）、系统适应性系统适应性溶液：精密称取达托霉素对照品P130125.01mg和25.11mg，分别置于2个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，作为STD1溶液和STD2溶液。当色谱系统平衡后，分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液，计算RSD%和回收率，结果见表1。表1.系统适应性结果STD1的RSD:≤2.0%STD2回收率：98.0～102.0%序号STD1峰面积STD2峰面积1st22610.222805.02nd22600.922695.43rd22595.2/4th22593.9/5th22555.1/平均值22591.122750.2RSD(%)0.090.34回收率(%)100.30结论：STD1的RSD%为0.09%，STD2的RSD%为0.34%，回收率为100.30%，均满足宜顺论文网认可标准，系统适应性良好。（二）、降解实验通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD检测器进行分析，判断方法的专属性及稳定性指示性。表2降解试验结果溶液名称新增杂质相对保留时间(RRT)酸解0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729碱解0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695氧化0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263光照0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.2076、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207避光0.6032、1.5221加热0.6032、0.6936、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972高湿0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1.5695、1.6207、1.6729（三）、专属性水解物单个专属性溶液：精密称取水解物P13015.327mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水=1：1溶解并定容至刻度。β-异构体单个专属性溶液：精密称取β-异构体P13015.930mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。脱水物单个专属性溶液：精密称取脱水物P13015.380mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。达托霉素样品溶液：精密称取达托霉素样品S13030125.78mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。混合溶液：精密称取达托霉素样品S13030125.85mg于50ml容量瓶中，分别加入各单个专属性溶液5.0ml，用稀释剂溶解并定容至刻度。分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液，考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰，相邻各组分间分离度，结果见表3。宜顺论文网专属性理论塔板数≥2000相邻组分间分离度≥1.0水解物β-异构体达托霉素脱水物单个组分保留时间(min)29.69731.78335.06839.943混合溶液各组分保留时间(min)29.72531.77734.77640.028相对保留时间(RRT)0.850.911.01.15与相邻前一个色谱峰间分离度1.081.521.831.11与相邻后一个色谱峰间分离度1.731.363.002.72理论塔板数29805324872531644523结论：各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准，专属性良好。（四）、定量限LOQ和检测限LOD1、定量限LOQ（1）、未知杂质定量限标准溶液：精密称取达托霉素对照品P130125.39mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。1.0%对照溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。未知杂质LOQ溶液：精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-1。表4-1未知杂质LOQ检测结果LO