AAV病毒包装

AAV病毒包装摘要:(一)AAV-293细胞的冻存(二)AAV-293细胞的传代(三)AAV-293细胞的复苏(四)AAV包装和浓缩(一)AAV-293细胞的冻存随着传代的次数增加，AAV-293细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉细胞培养上清液，加入PBS洗去残留的培养基;2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10%DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10%DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm/min，5min。去掉上清。5、根据细胞计数,结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)重悬细胞，密度为3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。(二)AAV-293细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。(三)AAV-293细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为37~42℃的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套，防止被冻伤)，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm/min，5min。4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。(四)AAV包装和浓缩1.质粒扩增构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul，A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。2.传AAV-293细胞将培养AAV-293细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37度水浴中预热的10%DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10%DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/mL细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75;若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL10%DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。3.做脂转complex试剂名称试剂数量载体质粒5ul(1.0ug/ul)包装质粒5ul(1.0ug/ul)辅助质粒5ul(1.0ug/ul)注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。4.AAV病毒收毒：病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。1)准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37°C水浴;2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中;3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1mlPBS重悬;4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。5.AAV病毒浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。2)将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质3)加入1/2体积的1MNaCl，10%PEG8000溶液，混合均匀，4度过夜4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌。5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37°C孵育30分钟;6)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。6.AAV的纯化1)向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372);2)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/mlCsCl溶液将离心管剩余空间填满;3)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有AAV颗粒的组分;4)重复上述过程一次。5)将病毒装入100kDa的透析袋，4度透析脱盐过夜。此即为纯化的AAV病毒AAV病毒包装滴度测定(采用Q-PCR法)1)取20ul浓缩病毒液，加入1ulRNAse-freeDNAse，混匀，37℃水浴反应30min。2)4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到另一个无菌的1.5mlEP管中。3)加入90ulDilutionBuffer(1mMTris-HCl,pH8.0，0.1mMEDTA，150mMNaCl)，混匀，37℃金属浴反应30min。4)自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h。5)100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温。6)进行Q-PCR检测滴度。AAV病毒的储存、稀释1.病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管，并使用封口膜封口)。1)病毒可以存放于-80℃6个月以上;但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新测定病毒滴度。2)反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融，建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。2.病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS缓冲液或培养目的细胞无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)分装后使用。AAV使用安全注意事项1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。2.病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液等请用84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。5.如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。6.脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。