乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达

微生物学通报APR20,2009,36(4):551~556Microbiology©2009byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：国家863计划项目(No.2006AA06Z322);国家自然科学基金项目(No.30800031);广东省科技攻关项目(No.2007A020300007);广东省科技计划项目(No.2007A020903001);广东省科学院人才基金项目(No.200601)*通讯作者：Tel:[phone];:[e-mail]收稿日期：2009-02-12;接受日期：2009-02-16研究报告乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达陈亮1,2,3任随周2,3*许玫英2,3孙国萍2,3(1.中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉430071)(2.广东省微生物研究所广东广州510070)(3.广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070)摘要:本文考察了乳糖代替IPTG诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG诱导的差异等方面进行了比较分析,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明,在工程菌对数生长中期(OD600约为0.8)添加终浓度为0.4mmol/L的乳糖诱导6h的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。由于乳糖可以作为碳源被菌体利用,分批添加乳糖效果优于一次性添加。乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%,与IPTG诱导条件下的35.03%无明显差异。乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后,但收获的菌体量高于IPTG诱导,显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂,可以代替昂贵的IPTG用于脱色酶TpmD的规模化发酵,同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。关键词:乳糖诱导,IPTG,TpmD,T7启动子Over-expressionofHighlyActiveTriphenylmethaneDyesDecolorizationEnzyme(TpmD)InducedbyLactoseInsteadofIPTGinEscherichiacoliBL21(DE3)CHENLiang1,2,3RENSui-Zhou2,3*XUMei-Ying2,3SUNGuo-Ping2,3(1.WuhaninstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan,Hubei430071,China)(2.GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou,Guangdong510070,China)(3.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication,Guangzhou,Guangdong510070,China)Abstract:ThefeasibilityofexpressionofTpmDinrecombinantE.coliBL21(DE3)inducedbylactoseinsteadofIPTGwasinvestigated.Thefactorsaffectingtheinductionoftargetgeneexpressionsuchastheoptimaltimepointforinduction,theconcentrationandadditionmodeoftheinducer(lactose)andtheinductiontimeweredetermined.Itisestablishedthattheoptimalinductionmethodistoadd0.4mmol/L(finalconcentration)lactoseatthemid-log-phaseofcellgrowth,(OD600≈0.8)andincubateat552微生物学通报2009,Vol.36,No.4°Cfor6h.Itwouldbebettertoaddthelactosein4batches(0.1mmol/Lperbatch),becauselactosecanbeusedasacarbonsourcebyE.coliBL21(DE3).TheproductionofTpmDenzymeinducedbylactosewasabout35.62%ofthebacterialtotalproteinwhichwasnosignificantlydifferentfromthatinducedbyIPTG(≈35.03%),andtheexpressionofTpmDwasalittleslowerthanthatinducedbyIPTG.However,thefinalbiomassinducedbylactosewashigherthanthatinducedbyIPTG.TheseresultssuggestedthatthelactoseisaseffectiveasIPTGforT7promoterinductionandshouldbeeasilyscaledupforindustrialproductionofrecombinantproteinwithlowercost.Keywords:Lactoseintroduction,IPTG,TpmD,T7promoter三苯基甲烷类染料是用量昀大的三大类染料之一,被广泛应用在纺织、印刷、食品、化妆品、医药、皮革、涂料、油墨等多个行业。这类染料结构稳定,很难被生物分解。其中孔雀石绿和结晶紫因在鱼体内和环境中残留时间长,并有致突变、致畸和致癌的危险,美国及欧盟已经禁止将孔雀绿和结晶紫作为人用和兽用药品[1],我国也为此制定了检测水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的国家标准[2]。2005年引起社会高度关注的“孔雀绿污染水产品”事件,对水产养殖各方面都造成了严重的影响。孔雀石绿作为杀菌剂被国家禁用后,仍然屡屡发生水产品孔雀石绿污染事件,一个重要的原因是养殖水体和底泥中残留的孔雀石绿未能得到彻底净化,从而造成二次污染。针对孔雀石绿造成的污染养殖水体的生物修复是一个与食品安全密切相关的新课题,而获得高效净化此类污染物的微生物资源则是开发孔雀石绿污染生物修复技术和产品的前提条件和关键环节。嗜水气单胞菌DN322是任随周等[3]从活性污泥中分离到的一株广谱脱色菌,能够高效降解结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料;其降解酶(命名为TpmD)能够裂解三苯基甲烷类染料骨架结构,是一种新发现的细菌氧化酶[4,5]。该菌株对三苯基甲烷类染料高效脱色的功能对于染料和染色废水处理工程中脱色难题的解决具有很高的应用价值,但由于嗜水气单胞菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性,从而限制了该菌株在环境生物修复中的广泛应用。因此有必要探寻既能有效利用TpmD氧化酶的独特脱色降解功能、又能避开嗜水气单胞菌的潜在致病性的应用技术新途径。本实验室在前期工作中利用表达载体pET22b(+)已成功构建了可以高效表达脱色酶TpmD的工程菌,具有良好的开发潜力。IPTG(异丙基-β-D巯基半乳糖苷)是一种非常高效的乳糖启动子诱导剂,但由于其具有潜在的毒性[6],对菌体生长具有一定的抑制作用,并且价格昂贵,因而不适宜在发酵罐中进行基因工程产品的规模化生产。乳糖是一种二糖,没有毒性,天然具有诱导乳糖操纵子的作用,且价廉易得,因而有可能成为替代IPTG的诱导剂。但乳糖本身作为一种碳源可以被菌体代谢利用,因而对于菌体的生理及代谢也有一定程度的影响。乳糖作为诱导剂,其诱导的机制不同于IPTG。IPTG可以直接进入大肠杆菌细胞内部而发挥诱导作用,且它是一种非代谢性的诱导物,不会被菌体所消耗,只需极少量的存在就能稳定地诱导乳糖启动子的转录;乳糖却需要借助于乳糖透过酶(Permase)的作用进入细胞,然后经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖(Allolactose)才能起到诱导剂的作用[7,8]。同IPTG相比,乳糖作为诱导剂对于乳糖操纵子的诱导调控过程更为复杂。但乳糖所具有的价廉易得,无毒高效的特点,使得利用乳糖代替IPTG作为诱导剂的研究,对于各种利用原核表达系统进行重组蛋白的大规模生产,具有十分重要的现实意义和应用价值。本研究是在前文(投稿中)将AeromonashydrophilaDN322的脱色酶基因(tpmD)克隆在表达载体上做异源表达,以IPTG诱导获得大量高活性可溶酶蛋白的基础上,发展用廉价的乳糖代替IPTG诱导T7启动子获得高效表达的相关参数,如添加乳糖的时机、浓度范围及诱导时间跨度等关键因素进行比较分析,确定昀佳可操作的诱导条件,以期为三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的规模化发酵和基因工程重组蛋白的工业化生产提供有益参考。陈亮等:乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达553材料与方法1.1实验材料1.1.1菌株和质粒：含pET22-TpmD重组质粒的表达菌株E.coliBL21(DE3)由本实验室构建和保存。1.1.2酶和试剂：胰化蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(YeastExtract)购自英国OXOID公司;乳糖(Lactose)、IPTG购自Sigma公司;Taq酶、质粒提取试剂盒和Bradford蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。1.2实验方法1.2.1菌体生长及目的蛋白表达量的测定方法：摇瓶LB培养基配方参照文献[9];菌体生长量以OD600值表示;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)参照文献[10]。诱导后离心收集的菌体总蛋白经变性预处理后进行SDS-PAGE电泳,采用GEImageQuant350凝胶成像系统中的ImageQuantTL软件分析表达的目的蛋白占总蛋白的比例。1.2.2菌株昀佳诱导起始生长量的确定：分别在重组菌生长0h、1h、2h、3h、4h后,向培养液中加入乳糖至浓度0.4mmol/L,37°C继续诱导4h,取样电泳后测定TpmD的表达量,并检测昀终菌体生长量。1.2.3乳糖诱导昀佳浓度的确定：分别向处于对数生长期的菌体培养液中加入不同量的乳糖,使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、8.0mmol/L,37°C继续诱导6h。收集菌体后电泳检测TpmD基因的表达量,并测定菌体的昀终生长量。1.2.4乳糖昀佳诱导浓度的表达动力学研究：根据上述实验结果,以昀佳浓度向培养液中加入乳糖后,37°C持续诱导,在1h、2h、4h、6h和8h测定菌体生长量并留样进行SDS-PAGE电泳。同时以终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导作为对照。1.2.5乳糖添加方式对目的蛋白表达量的影响：当菌体生长量达到昀佳诱导点时,每隔1h添加1次乳糖,使其浓度为0.1mmol/L。经过4次添加后,继续诱导3h。另外,以一次性加入的方式添加乳糖至终浓度0.4mmol/L(昀适浓度),经相同时间(7h)诱导后,分别收集不同添加方式诱导的菌体,取样电泳检测TpmD的表达量。同时以1h为间隔检测菌体生长量。1.2.6粗酶液的制备及酶活力的测定：取经乳糖诱导表达后的菌液,离心收集菌体,用磷酸缓冲液(PBS)重悬,使用SONICSVC505超声波细胞破碎仪(功率500W,振幅35%,每个循环超声3s,冷却2s,180次)超声破碎菌体。经破碎后的菌液于4°C、13000r/min离心15min,收集上清即为粗酶液。酶活测定在30°C条件下进行,反应总体积为10