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分子生物学实验指导1第一部分分子生物学实验入门一、实验室规则（一）实验室安全规则1．水电使用安全规则：注意节约用水（不管是自来水还是纯净水），清洗器皿时，先用自来水洗干净后，根据实验需要再用纯净水冲洗l～3遍；随时注意水龙头是否关掉，水池是否堵塞、漏水；注意节约用电，不能随意调节空调，仪器使用前应了解是否漏电、短路，使用完后按操作程序关掉电源；最后离开实验室的同学应检查实验室的照明灯、仪器电源、水龙头是否关掉。2．药品使用安全规则：易燃易爆药品远离火源；注意有毒或腐蚀性药品—的使用方法；绝对禁止药品、试剂间的相互污染；废弃液体入水池后用水冲掉，固体废弃物严禁入水池；有毒废弃物倒到指定地点。3．仪器使用安全规则：实验室任何仪器不能随意操作，严格按照操作规程进行；仪器在使用过程中出现故障要报告，不能自行处理；使用完仪器后要清洁仪器和台面并记录仪器使用情况。（二）实验室卫生规则1．维护实验室的清洁卫生：不能随地吐痰，乱扔废纸屑等物品。每小组实验完后清洗器皿和清理台面。2．严格执行卫生值日制：实验完后实验室的清洁卫生由值日小组按照布置严格执行，不能无故不做。（三）学生守则1．每位同学都应衣冠整齐，自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不得无故迟到早退，保持室内安静。2．注意实验室环境、仪器和实验桌面的整洁，每次实验完成后该清洗的器皿清洗完后按原位放好，经老师检查后方可离开。3．每次开始做实验前，应预习好实验指导，要充分了解实验原理、方法及仪器设备的使用方法，原则上按照实验指导的方法进行，如经预习，查资料后，有更好的实验方法，可与老师讨论后进行，鼓励创新。4．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的分子生物学实验指导2纯净，严防混杂。5．注意安全。易燃易爆物远离火源，注意有毒或腐蚀药品的使用方法，玻璃器皿的使用、洗涤，尽可能减少损坏、割伤手。行走时不要碰撞他物。废弃液体倒入水槽并用水冲走，固体废弃物严禁入水槽，应丢入垃圾桶中。6．实验室的清洁卫生及安全值日，经老师或班长安排后，严格执行。7．应注意同学之间相互协作能力方面的培养。8．真实认真地对待每次实验，记录好实验结果，实验完后，交实验报告或签名后方可离开。二、常用仪器的使用方法（一）离心机离心机种类很多，有大型落地式的冷冻离心机，非冷冻台式离心机；按转速分为：超速、高速、低速离心机等，主要是由冷冻装置、调速装置、转轴、转头等组成。其基本操作过程如下：1．转速调到零位，接通电源。2．是冷冻离心机则调温度为所需温度，冷机开始工作。3．将所离心的物质于离心管进行平衡后，放于转头相对应位置。4．盖好转头盖和外盖，调转速为所需转速，高速时注意离心力与转速的换算RCF=1.119x10-5x半径x转速（r／min），调所需的离心时间。5．启动离心机，进入离心过程。6．到了时间，转速指示为零时，打开离心机盖，小心拿出离心管（防震动）。7．使调速旋钮为零位，断电，清洁离心机。不同离心机的使用方法，请看各自说明书。（二）微量移液器每一把移液器都有一定的移液范围，使用之前请选择。1．用旋钮调节到所需要的体积刻度，注意，使用旋钮时，绝对禁止超出刻度范围。2．选择吸头牢固地装在管嘴锥上，注意，保证吸头上无任何异物。3．当移液管、吸头和溶液的温度一致时，开始移液。4．将按钮压至第一停点位置。5．将移液管吸头浸入液面2—3mm深处，然后慢慢吸入液体。当吸头吸满液体后，分子生物学实验指导3将吸头撤出液面，擦掉吸头外侧的所有液滴。注意，不要触及吸嘴口。6．轻轻压下按钮至第一停点位置，放出液体。约一秒钟后，继续将按钮压至第二停点位置。待吸管液体放干净后，将吸头贴在容器壁上防止形成液滴滴入瓶中。撤出吸头。7．松开按钮使之回到起始位置。必要时换掉吸头以同样的操作吸另一种溶液。（三）电子天平电子天平型号不同，称量范围、灵敏度等也不同。可以参看各自型号的说明。下面以DT200为例介绍操作方法。1．接通220V电源（应有良好地线），打开电源开关，此时，天平内部电源开始工作，而微机处于不工作状态不显示。2．在空称盘时，按一下ON／OFF键，显示窗内绿色显示器全亮88888后，接着依次显示E-1至E-9，表示微机正在检查天平各个部分，然后，显示0.0g，下面可进入正常称量工作（为保证称量稳定，天平应开机后预热15min后称量）。3．当称盘上放皮重时待天平显示稳定后按一下去皮键T显示值为0.0g后再称量，显示为净重。拿掉载荷后，显示载荷的负值，再按一下去皮键，显示回零值。4．称量完后，关掉电源，清洁天平。三、器皿的洗涤及要求（一）一般实验要求1．初用玻璃器皿的洗涤新购买的玻璃器皿表面常附着有游离的碱性物质，可选用洗衣粉（或去污粉）洗刷，再用自来水洗净（洗净的标志是器壁不挂水珠或无油污迹象），然后浸泡在1％一2％盐酸溶液中过夜（不少于4h），再用自来水冲洗，最后用蒸馏水或去离子水洗2～3遍（此目的是洗掉器皿表面的自来水，用少量多次法，注意节约用水），自然控干或在60～100℃烘箱内烘干备用。2．使用过的玻璃器皿的洗涤（1）一般玻璃器皿，如试管、烧杯、锥瓶、量筒等，先用自来水洗刷至无污物，浸泡于洗衣粉水（或用毛刷沾取去污粉于壁内外），再用大小合适的毛刷细心刷洗（禁止粗暴洗而损坏器皿），用自来水冲洗干净，观察是否干净（同上标志）后，用蒸馏水或去离子水冲洗2～3遍，自然控干或烘干备用（难以洗去的污物，可选用适合的洗液浸泡涮分子生物学实验指导4洗）。（2）量器，如吸量管、滴定管、容量瓶等。使用后应立即浸泡于水中，勿使物质干涸。使用完毕后用流水冲洗，以除去附着的试剂、蛋白质等物质，控干后浸泡在铬酸洗液中4～6h（或过夜），再用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3遍，风干备用。（3）其他，如装过传染性样品的容器（病毒或微生物、病人血清等），应先进行消毒（高压等方法）再进行如上的洗涤。（二）分子生物学实验要求1．所有玻璃制品洗涤方法同上，但均需高压灭菌，而买来的塑料制品不少已经灭菌，要看说明，有些塑料制品不能高压灭菌（可能会变形等），要用丁射线灭菌（这些基本上是厂家已经灭菌好的一次性用品，现在常使用的小离心管和吸头均可进行高压灭菌。2．某些特殊实验（如处理极小量的单链DNA或用Maxam-Gilbert法进行测序），则以使用覆盖有硅甲烷薄层的玻璃或塑料制品为宜。具体操作如下：（1）将待硅烷化的物品（吸头、试管、烧杯等）放入一个大的玻璃干燥器内。（2）干燥器内放置一小烧杯，内装1ml二氯二甲硅烷（小心，此物有毒和挥发性，务必在通风橱中进行）。（3）通过接液瓶将干燥器与真空泵相连，开启真空系统抽气至二氯二甲硅烷开始沸腾，立即切断真空泵与干燥器之间的连接管道，关闭真空泵。干燥器应维持真空状态（一旦二氯二甲硅烷开始沸腾，必须马上关闭真空泵，否则，挥发剂将被抽入真空泵而无法挽救地破坏真空泵）。（4）待二氯二甲硅烷挥发至尽（1～2h），在化学通风橱中打开干燥器。让二氯二甲硅烷烟雾分散后，取出器皿，玻璃制品和玻璃棉使用前应于180℃烘烤2小时。塑料制品不应高压灭菌，但使用前须用水彻底冲洗。大件玻璃制品的硅烷化是把物品用氯仿或庚烷配制的5％二氯二甲硅烷浸泡或漂洗，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上，用前反复冲洗多次或于180℃烘烤2小时。四、实验结果的记录及保存准备一个实验记录本，将预习和阶段性结果或最后结果记录于此。应真实记录实验结果。生物化学与分子生物学实验的结果有数据、现象和图谱。1．数据的记录分子生物学实验指导5在预习中列表格。实验中，一个样品最少测2次并求平均值。有的实验要求对单次测量结果求出相对偏差、平均偏差、标准偏差、相对标准偏差等，可按有关公式计算。2．现象的记录在记录本中如实描述所产生的现象。3．图谱的记录如电泳后的结果，可以通过照相或描画（根据实验室条件进行）。每次实验结果记录完成以后，样品（如试管中的溶液、电泳凝胶等）保存一段时间，与所记录的结果核实一遍，确认无误后，冲洗掉或弃去。如是阶段性结果，后面的实验还要用，应封闭后（根据不同温度要求）于冰箱冷冻或冷藏保存。五、实验报告的完成阶段性的实验不要求写实验报告，一个大实验完成以后，写综合性的实验报告（如同论文的形式），格式为：标题（4号字）姓名、学号、班级（5号字）摘要及关键词（小5号字）引言进入正文：1材料与方法1．1材料1．1．1材料1．1．2试剂1．2方法2结果，3讨论六、实验成绩评分方法实验操作30％（实验前是否有预习、实验是否积极参与、器皿仪器是否会用等）。实验报告40％（是否按格式写、是否简明扼要重点突出、结果好坏及讨论是否正确）。实验素质20％（是否遵守实验室规则和学生守则）。实验考试10％（根据实验中出现的问题临时决定方式）。分子生物学实验指导6第二部分分子生物学实验实验一质粒DNA的提取【目的和要求】1．学习载体的基本结构。2．了解碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想。3．掌握提取质粒实验中的各项基本技术。4．提取载体和含插入片段的供体质粒。【实验原理】基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒等载体。载体必须具备以下基本条件：1．复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制繁殖。2．有一个或多个利于检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。3．有一个或多个限制性内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。4．适当的拷贝数：较高的拷贝数有利于载体的制备，使细胞中克隆基因的数量增加。质粒是基因工程中的常用载体之一，是染色体外小型的双链环状的DNA，大小在l～200kb之间，可自主复制，每个细胞拷贝数可达500～700个。如典型的pUC系列质粒载体pUCl8，它含有pBR322的复制起始位点，ampr以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因lacZ的启动子及其编码α肽链的DNA序列，并有一段多克隆位点区段（MCS）。当外源DNA插入时，形成无活性的半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌就在X-gal-IPTG平板上形成白色菌落，当没有外源基因插入时则形成蓝色菌落。质粒DNA的提取是基因工程操作中最常用与基本的技术，已有多种方法可供选择。例如利用碱性或煮沸条件下质粒DNA和染色体DNA变性、复性的不同来进行分离的碱法；利用EB（溴化乙锭）插入造成不同构型的DNA浮力密度不同的CsCl法；利用在酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布而开环和线性分子在酚相中分布进行分离的酸酚法；以及现在利用玻璃纤维膜吸附DNA的快速抽提法等。质粒提取一般步骤如下：细菌培养物的生长，细菌的收获和裂解，质粒DNA的纯化等，通常用离心的方法去除各种细胞碎片，用饱和酚处理去除蛋白质，用RNA酶处理去除RNA等，最后用乙醇沉淀达到浓缩的目的。一般lml菌液可获得约3～5μg质粒分子生物学实验指导7DNA。碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。【教学内容】1．质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍。2．碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒。【实验器材和试剂】1．器材恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、振荡器、恒温水浴、微量移液器（20μl，200μl，1000μl）、1.5mlEnpendorf管。2．材料与试剂（1）LB液体培养基：酵母提取物5g／L，蛋白胨10g／L，NaCl10g／L，p