《农产品质量安全检测技术培训系列之

农残检测常用方法技术要点卞红正安徽省农产品质量安全检测中心农业部农产品质量安全监督检验测试中心（合肥）★农产品质量安全检测技术系列之主要内容速测方法3准确定性定量检测法4当前常用检测方法2前言1以前农残检测方法的颁布：国家标准化管理委员会颁布国家标准（GB）;农业部颁布行业标准（NY）;国家进出口商品检验检疫总局颁布行业标准，编号为SN。已颁布标准截至目前，已颁布的农产品和食品农药残留检测方法标准共有390多个。其中：国家标准92个，农业行业标准35个，商检行业标准约270个。前言根据2009年6月1日实施的《中华人民共和国食品安全法》第二十一条和第二十二条的规定，今后凡涉及食品安全的标准（八个方面），统一由国务院卫生行政部门部制定和颁布，国务院标准化行政部门提供国家标准编号。对现行的食用农产品质量安全标准、食品卫生标准、食品质量标准和有关食品的行业标准中强制执行的标准予以整合，统一公布为食品安全国家标准。农残检测方法标准全部统一为食品安全国家标准。前言1.速测方法GB/T5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》NY/T448-2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》一、当前常用检测方法NY/T761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》QuEChERSMethod（美国农业部农业研究服务中心）修订方法NY/T761-2008、GB/T19648-2006《水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留的测定气相色谱-质谱法》、GB/T20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》等方法糅合在一起的实施细则2.准确定性定量检测法一、当前常用检测方法二、速测方法1．快速检测程序试样检测阴性阳性复测（两次以上）阴性阳性根据市场规定处理准确定量定性分析二、速测方法GB/T5009.199-2003NY/T448-2001适用范围蔬菜（葱蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄含有抑制酶的植物次生物质，易导致假阳性；叶绿素高的也会干扰，这两类可整株取样）适用叶菜(除韭菜)、果菜、豆菜、瓜菜、根菜(除萝卜、茭白等)方法速测卡法(纸片法)和酶抑制率法(分光光度法)酶抑制率法(分光光度法)波长412nm410±3nm酶乙酰胆碱酯酶（用pH8磷酸缓冲液溶解）（3min吸光度变化值＞0.3，4℃冰箱保存不超过4天）丁酰胆碱酯酶（用pH8磷酸缓冲液溶解）3min吸光度变化值0.4—0.8之间底物硫代乙酰胆碱（蒸馏水溶解，4℃冰箱保存不超过2周）碘化硫代丁酰胆碱（BTCI）（用pH8磷酸缓冲液溶解）显色剂二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）+碳酸氢钠缓冲液溶液，4℃冰箱保存二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）缓冲液溶解步骤取表面干净的蔬菜或瓜果，叶菜类取叶片部分，瓜果取表皮带肉，剪成1cm左右见方碎片。取样1g置于小烧杯内，加入5mL缓冲溶液，振荡1-2min，倒出并静置3-5分钟；于小试管内分别加入2.5mL样本提取液、100uL酶液、100uL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上，加入100uL底物，应立即倒入仪器比色皿中，记录3min吸光度变化值。取2g切碎的样本（非叶菜类取4g）放入提取瓶内，加入20mL缓冲液，振荡1-2min，倒出并静置3-5分钟；于小试管内分别加入50uL酶液、3mL样本提取液、50uL显色剂，于37-38℃下放置30min后分别加入50uL底物，倒入比色皿中，用仪器测定。结果抑制率≥50%：阳性（阳性样品需要重复检测2次以上，若不合格,用色谱、质谱等进一步定性定量分析）抑制率≥70%：阳性（阳性样品应有2次以上的重复检测，若不合格,用色谱、质谱等进一步定性定量分析）备注1、当温度低于37℃时，酶反应速度放慢，加入酶液和显色剂后反应时间应该延长，延长时间的确定，应以空白对照测试3min吸光度变化值＞0.3方可进行下一步操作。2、3min吸光度变化值＜0.3原因：①酶的活性不够；②酶的活性太低。3、样品检测放置时间与空白的时间应该一致。1、样品检测放置时间与空白的时间应该一致。2、丁酰胆碱酯酶对乐果、甲基对硫磷、毒死蜱、二嗪磷等农药不太灵敏，检出浓度均在10mg/kg以上。二、速测方法2．结果计算抑制率（%）=抑制率：酶被抑制的程度△Ac—对照组3min后与3min前吸光值之差;△As—样本3min后与3min前吸光值之差。100cscAAA二、速测方法3．注意事项2011年首届全省农产品质量安全检测技术人员大比武现场操作评分细则（农残速测类）(2011年)中对取样部位、处理方法等内容进行详细的分项打分，这些打分项都是平时检测中需要注意的地方。适用范围：蔬菜（葱蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄含有抑制酶的植物次生物质，易导致假阳性；叶绿素高的也会干扰，这两类可整株取样）；农药：有机磷和氨基甲酸酯类。所有操作步骤顺序、加液量、处理时间一定要严格按标准执行。建议使用同一批比色皿，不同批次的比色皿对结果可能存在影响。一批上机样品同时检测，共用一个对照。检测前一定要检查酶液活性（3min吸光度变化值＞0.3）；酶液反复解冻最多不超过两次,否则会影响酶活性。二、速测方法4．如何看待农残快速测定方法何为快速检测方法？指检测速度相对较快、便于现场筛查的检测方法。其主要适合于定性和半定量测定，检测准确度相对要差一些。法律地位《中华人民共和国农产品质量安全法》第三十六条规定“……采用国务院农业行政主管部门会同有关部门认定的快速检测方法进行农产品质量安全监督抽查检测，被抽查人对检测结果有异议的，可以自收到检测结果时起四小时内申请复检。复检不得采用快速检测方法。”二、速测方法5．农残速测与色谱、质谱等方法的结果比较时间：从2005年至2007年。项目：农业部开展的省份间农产品质量安全例行监测互查。要求：承担任务的37个部级中心分别用农残速测进行初步筛查，并把所有样品用NY/T761等方法进行色谱、质谱定量检测。目的：想验证速测与色谱检测的相关性，如果有相关性，就可以先用速测初步筛查，然后把阳性（超标的）样品再用色谱等方法准确定量，那样可以大大减少工作量。结论：速测结果和色谱等定量检测结果几乎没有任何相关性。说白了就是速测超标的，色谱检测不出来，速测不超标的，色谱可能会超标。因为没有什么相关性，农业部在省部级检测中心这个层级最终导致放弃速测方法。★★所以，速测仅仅是法律认可的一项工作，不要较真，如被检方有异议，更不能拿速测阳性结果进行处罚和仲裁。二、速测方法6．为什么采用农残快速检测法（非官方解释——最实在的理解）①鲜活农产品不宜长时间保存，快速检测方法克服了当前所有准确定量方法（色谱、质谱方法等）检测周期过长的问题。【时限性考虑】②我国研究院所和各地市针对特殊样品，采用酶抑制法取得了与准确定量方法（色谱、质谱方法等）一致性结果。【所谓的科学依据】③快速检测方法是经过农业部会同有关部门认定发布的，经法律认可的方法，具有权威性和统一性（不过可靠性谈不上）。【法律依据】④快速检测方法所需设备简单，易掌握，平时运营成本相对较低，选用该法主要是从我国从业人员素质、经济状况的国情出发来考虑的（不可能要求大家都去买质谱、色谱等设备）。【方法经济性、操控性】⑤明知快速检测方法准确度不高，选用该法，主要是在县级、乡镇等一级进行普及，让经营户、老百姓发现有人在抓农产品质量安全，更主要的是起到震慑作用。【震慑作用】【案例】河南省郑州市农残快速检测网络【案例】河南省郑州市农残快速检测网络三、准确定性定量检测法1．基本步骤：检测前工作准备提取净化、浓缩定容标准溶液配制和测定结果计算三、准确定性定量检测法2．提取条件的优化：QuEChERS方法选择单一乙腈为提取溶剂。含水量低或含糖量高的样品应加入一定量的水后再进行提取，以提高提取效率。乙腈对N-三卤甲硫基杀菌剂类农药，具有降解作用，如克菌丹、抑菌灵等；通过加入1%的醋酸，调节pH值，能够抑制上述农药的分解。三、准确定性定量检测法3．盐析：盐析剂种类：氯化钠、醋酸钠和硫酸铵等；盐析剂能与水结合使游离水分子减少，减少了农药在水相中的溶解度；盐析剂能减少有机溶剂在水中的溶解度；盐析剂能使水相的比重增大，有助于分离。三、准确定性定量检测法4．脱水剂的选择：无水硫酸镁吸水能力比无水硫酸钠高3倍。无水硫酸镁吸水的同时也放热，促进农药的萃取。无机盐加入量（g）乙腈中的水分（加入前，%）乙腈中的水分（加入后，%）NaCl2g/27mL276.0Na2SO40.8g/4mL63.9MgSO40.8g/4mL60.6三、准确定性定量检测法5．净化剂的选择：PSA提供伯氨基和仲氨基，相比氨基更能去除基质干扰；主要用来消除各种有机酸、色素以及一些糖和脂肪酸。为了减少仪器的维护，往往在PSA的基础上加C18净化。PSA可去除90％以上的脂肪酸和50％左右的色素。GCB可去除90％以上的色素，但对脂肪酸的净化能力仅有10％左右。对于一些含色素高的样品，将两者联合使用。但用量要适当，否则会吸附一些平面结构的农药，影响回收率，如六氯苯、百菌清等。净化剂去杂种类PSA糖、有机酸、色素等C18油脂、非极性干扰物等GCB色素、甾醇、非极性干扰物等方法1：NY/T761-2008方法名称及来源：《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法》NY/T761-2008。农药种类和个数：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药等共104种。使用仪器：GC、LC。检测步骤：加入2mL丙酮丙酮定容至5.0mLGC检测（FPD）加入2mL正己烷5mL丙酮＋正己烷(10＋90)淋洗，重复一次依次5mL丙酮+正己烷(10+90),5mL正己烷预淋弗罗里矽柱50℃水浴氮吹近干正己烷定容5.0mLGC检测（ECD）加入2mL甲醇＋二氯甲烷(1+99)2mL甲醇＋二氯甲烷(1+99)淋洗，重复一次4mL甲醇＋二氯甲烷(1+99)预淋氨基柱50℃水浴氮吹近干甲醇定容2.50mLHPLC检测（柱后+荧光）过2µm滤膜25g样品，加入50mL乙腈高速匀浆2min过滤到添加5~7g氯化钠的100mL具塞量筒剧烈震荡1min后静置30min（实践中10min即可）分取10mL有机相，旋蒸近干，洗耳球吹干或80℃水浴氮气挥干方法1：NY/T761-2008方法2：NY/T761、GB/T19648和GB/T20769等综合法方法名称及来源：NY/T761-2008、GB/T19648-2006和GB/T20769-2008等，其中以GB/T19648-2006为主。农药种类和个数：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类和苯并咪唑类农药等800多种。使用仪器：GC、LC、GC-MS/MS和LC-MS/MS。检测步骤：所有洗脱液氮吹仪吹干；或旋蒸近干，洗耳球吹干5mL乙腈+甲苯预淋石墨化炭黑氨基柱（色素少，可用氨基柱代替）丙酮定容5.0mL移取2.5mL氮吹仪吹干，正己烷定容2.5mLGC-MS/MS和GC检测用2mL乙腈＋甲苯(3+1)涮洗浓缩瓶并倒入SPE小柱，重复2次剩余约20mL乙腈+甲苯分次或1次倒入，淋洗小柱移取2.5mL氮吹仪吹干，用甲醇+水（1+1）定容2.5mLLC-MS/MS和HPLC检测过0.22µm滤膜25g样品，加入50mL乙腈高速匀浆2min过滤到添加5~7g氯化钠的100mL具塞量筒中剧烈震荡1min后静置30min（实践中10min即可）分取10mL有机相，旋蒸或50℃水浴氮气至近干，加入2mL乙腈＋甲苯(3+1)洗脱液用量约为25mL方法2：NY/T761、GB/T19648和GB/T20769等综合法方法2：NY/T761、GB/T19648和GB/T20769等综合法方法2：NY/T761、GB/T19648和GB/T20769等综合法方法2：NY/T761、GB/T