肿瘤临床分子诊断技术的应用进展

肿瘤临床分子诊断技术的应用进展杜珍武[e-mail]吉林大学中日联谊医院中心研究室一、肿瘤发生发展的分子机制二、肿瘤分子诊断内容三、肿瘤治疗的分子监控四、肿瘤的免疫监控肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制肿瘤自身原因外因内因无限增殖转移空间资源免疫监控攘外安内同流和污视而不见肿瘤免疫监控失活功能丧失肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展LimitlessreplicativepotentialTissueinvasion&metastasisSustainedangiogenesisInsensitivitytoanti-growthsignalsSelf-sufficiencyingrowthsignalsEvadingapoptosis一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展Self-sufficiencyingrowthsignals•Autocrineloops•Over-expressionofreceptor•Receptorisalways‘on’•Downstreamsignals一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展•Externaltriggers•Intracellulartriggers•Deathreceptors•Caspases–Sensors(8,9)–Executioners(3)Evadingapoptosis一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展Insensitivitytoantigrowthsignals一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展Sustainedangiogenesis•VEGF•FGF1/2•Thrombospondin•Thalidomide•Avastin一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展Tissueinvasionandmetastases一、肿瘤发生发展的分子机制1、肿瘤自身肿瘤临床分子诊断技术的应用进展Limitlessreproductivepotential•Hayflickhypothesis•Limitednumberofdoublings•Telomeremaintenance•Telomerase•Notalltumorcellshavethispotential–Tumorstemcells(1)免疫监视系统要素识别力攻击力组成分工快速反应特异反应信息传递肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调（1）、免疫监视系统识别特异反应抗原递呈细胞肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调（1）、免疫监视系统攻击效应细胞肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调（2）、免疫监视系统与肿瘤发生证据体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。免疫缺陷与肿瘤发生免疫功能与肿瘤发展肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调（2）、免疫监视系统与肿瘤发生肿瘤监控失常原因识别问题肿瘤自身免疫细胞隐蔽抗原来源与正常细胞相同抗原递呈功能缺失无视肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调（2）、免疫监视系统与肿瘤发生肿瘤监控失常原因杀伤问题肿瘤自身免疫细胞杀伤免疫细胞抑制因子功能异常抑制性免疫细胞肿瘤临床分子诊断技术的应用进展一、肿瘤发生发展的分子机制2、免疫监控失调肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容诊断预后评估判定治疗效果分子内容基因突变基因表达有无类型位置效应有无水平效应临床应用检测技术PCR基因测序蛋白芯片核酸杂交免疫化学肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容样本内容与遗传有关的基因突变检测技术PCR基因测序蛋白芯片基因测序免疫化学血液肿瘤组织血浆DNA变化血浆变中癌基因表达检测肿瘤标志物的检测肿瘤细胞的基因突变肿瘤细胞的基因表达肿瘤细胞的蛋白表达PCR肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容肿瘤标志物的检测1978年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测。肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容肿瘤标志物的检测理想的TM特异性高，对肿瘤与非肿瘤鉴别的准确性可100%。敏感性高，能在极早期发现肿瘤的存在，不漏诊。在体液中的浓度应与瘤体大小、临床分期密切相关，并可据此判断预后。半衰期短，可根据其水平的升降监测治疗效果及肿瘤是否复发或转移。检测方法灵敏可靠，操作简便，价格低廉。肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容肿瘤标志物的检测肿瘤标志物的测定：包括测定血液、尿液中蛋白质（包括多肽）、脂类，糖类、核酸物质。肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学：引领21世纪生物科学1、蛋白检测•蛋白组学代表着对有机生物、器官和细胞器中所有蛋白的特性、分子量、结构和生物化疗、细胞功能加以明确•同时了解这些特性在空间、时间或不同生理状态下的变化肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学相同的基因组不同的蛋白组肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学在分子水平上描述蛋白和DNA的特性是理清基因功能的关键基因组学蛋白组学DNAmRNAt-RNAt-RNAt-RNAt-RNA核糖体(....)蛋白CHOPO4(....)翻译后修饰XX具有活性的蛋白肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容2、蛋白组学肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学表面增强激光解吸离子化(SELDI)化学表面–蛋白表达谱:疏水性H50–C9链H4–C16链阳离子WCX2-羧酸盐金属离子亲和层析金属螯合物(Cu,Ni,Zn,Ga,Mn,…)常态NP20–SiO2阴离子SAX2–4O铵盐PS-10orPS-20蛋白耦合抗体–抗原受体–配体DNA–蛋白生物表面–蛋白相互作用检测:肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容2、蛋白组学肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学•通过比较蛋白图谱可以容易地找出标志物•SELDI技术比2DPAGE速度快，可重复性高•这一技术用以发现多种疾病的生物标志物，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺和膀胱癌肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容2、蛋白组学肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学FDA于2009年9月11日批准了OVA1试验•首个FDA获准的基于蛋白水平的体外诊断多因素指数检测•首个FDA获准的用于卵巢癌术前和术后的预后检测•在血标本中检测5个蛋白–SELDI技术筛选出β2-微球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白A1、甲状腺素运载蛋白–CA125•预测良恶性可能肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容蛋白组学•将生物标志物的发现从实验室开拓到临床应用中•基于一项前瞻性双盲的临床研究，纳入27个机构共516例患者–269例患者只根据手术前信息进行评估–247例患者根据手术前信息和OVA1结果进行评估–OVA1检测能识别出额外的潜在恶性肿瘤患者•能够在盆腔包块中检查出是否罹患卵巢癌，并确定是否需要手术治疗，帮助病人和医护人员确定属于什么类型的手术，以及应该由谁负责实施。肿瘤临床分子诊断技术的应用进展三、肿瘤的分子诊断内容2、核酸检测血浆DNA(plasmaDNA)又被称为循环DNA(circulatingDNA),是存在于循环血液中的细胞外DNA(cell-freeDNA),它可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在,也可以游离DNA片断形式存在。由于健康状态下少量衰老死亡(坏死或凋亡)细胞的DNA的释放,健康人血液中存在一定量的游离DNA。同时,由于健康状态下,循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态,因此对于健康人而言,血液中循环DNA的水平能够维持在一个比较恒定的低水平。循环DNA能反映人体内新陈代谢的状况,是健康评判的一个重要指标。近年来的研究表明,人外周血液中的血浆循环DNA量和质的改变与多种疾病(包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官衰竭等)关系密切,因此血浆DNA作为一种无创性检测指标,有望成为某些疾病早期诊断、病程监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。（1）、血浆DNA含量检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容（1）、血浆DNA含量检测血浆DNA浓度检测研究发现，正常健康人群循环系统游离DNA平均约为7ng/ml；肿瘤患者循环系统游离DNA水平明显升高，可达到29ng/ml；术后游离DNA水平迅速下降至18ng/ml，并随病情的好转进一步下降。这种游离DNA的升高可发生在肿瘤早期，出现于临床症状发生之前。由于血清标本来源方便和非侵入性等优点，因此血液中游离DNA定量检测可预测受检者早期肿瘤的发生风险，从而采取有针对性的预防和治疗措施。肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容（1）、血浆DNA含量检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容（1）、血浆DNA含量检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容血浆DNA基因检测①检测DNA甲基化包括P16基因、MGMT基因、DAPK基因、TMS1基因、RASSF1A基因。②检测基因突变：K-RAS基因突变、P53基因突变、FHit基因突变。③微卫星检测：MSA-2,3,4,5,12,16检测（1）、血浆DNA含量检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容血浆RNA检测检测HER2/NEU以及HNrnp-b-1基因，文献报道联合两种基因可以发现100%肺癌患者。（1）、血浆DNA含量检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容（2）、基因组检测科学家们预计，当完成了人类基因组项目之后应该能够发现一些与人体常见疾病和性状相关的遗传信息。但人类基因组图谱公布之后大家突然发现，现实与预期的完全不同，科学家们居然一无所获。但我们真的就不能从人类基因组图谱当中发现一点有价值的东西吗？肿瘤临床分子诊断技术的应用进展三、肿瘤的分子诊断内容4、基因组检测肿瘤临床分子诊断技术的应用进展二、肿瘤的分子诊断内容（2）、基因组检测Dual-specificityphosphatase6(DUSP6),monocyte-to-macrophagedifferentiationassociatedprotein(MMD),signaltransducerandactivatoroftranscription1(STAT1),v-erb-b2avianerythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog3(ERBB3),lymphocyte-specificproteintyrosinekinase(LCK).结论五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关肿瘤临床分子诊断技术的应用进展三、肿瘤的分子诊断内容4、基因组检测根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分析非小细胞肺癌患者的生存时间Overallsurvivalandrelapse-freesurvivalareshownforthe101patientswithNSCLC(PanelAandPanelB,respectively)andforth