三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究

第二军医大学硕士学位论文三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究姓名：孙培欣申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：秦路平2011-06三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究摘要内生真菌（endophyticfungi）是指那些在其生活史中某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，包括营表生的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根菌。近年来的研究发现，植物内生真菌具有抗真菌、抗肿瘤和抗氧化等作用，同时与植物有一定的共生进化关系。这些作用的存在与植物内生真菌产生的新天然产物，甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物有很大的相关性，因而对植物内生真菌的研究可以寻找植物与内生真菌的协同进化关系，同时又是一个寻找天然产物的重要途径。本课题以药用植物三尖杉(Cephalotaxusfortunei)为研究材料，在内生真菌的种类组成、内生真菌活性菌株的筛选及内生真菌菌株次生代谢产物探索等方面进行研究。取得如下结果：从浙江建德地区三尖杉样品树皮中共分离得到内生真菌160株，经过形态鉴定与分子鉴定，确定分属于10个目、14个科、16个属一共20个分类单元。根据形态鉴定的结果及对不产孢菌株形态型的划分结果，选取20个分类单元中的三尖杉内生真菌的代表菌株，以稻瘟霉(PyriculariaoryzaeP-2b)为筛选模型，初步筛选内生真菌发酵产物活性，其中8株（40.0%）有抑制稻瘟霉活性。进一步体外抗真菌、抗肿瘤研究发现，5株（25.0%）内生真菌产物的抗白色念珠菌(Candidaalbicans)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)、薰烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)活性较好，4株（20.0%）内生真菌产物的抗胃癌细胞（MKN45）、肠癌细胞（LOVO）、肝癌细胞（HepG2）、白血病细胞（HL-60）活性较好。其中，以菌株S361（Trichodermaatroviride）的抗真菌活性与S261（Penicilliumsp.）的抗肿瘤活性昀为显著。选取菌株S361与菌株S261，分别大量发酵，对其发酵产物的萃取产物进行化学分离。采用柱层析和制备薄层色谱等方法从S361发酵液的乙酸乙酯部位（AEF）中分离得到20个化合物，经波谱学分析以及对照品比较的方法，鉴定了其中15个化合物，其中3个trichodermaninA,trichoderiolsAandB为新化合物。从S261发酵液的乙酸乙酯部位（AEF）中分离得到11个化合物，经波谱学分析以及对照品比较的方法，鉴定了其中5个，均为已知化合物。对3个新化合物分别进行了抗真菌以及抗肿瘤活性检测。发现trichodermaninA对于白色念珠菌(Candidaalbicans)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)有较好的-1-第二军医大学硕士学位论文抑制作用；trichoderiolsA对于新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)有较好的抑制作用；trichoderiolsB对于新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)有较好的抑制作用。3个化合的抗肿瘤活性一般，对胃癌细胞（MKN45）、肠癌细胞（LOVO）、肝癌细胞（HepG2）、白血病细胞（HL-60）均无明显的抑制活性。通过以上研究，得到一些有意义的结果，主要包括：（1）从三尖杉中分离得到160株内生真菌，对部分菌株进行了鉴定，并且筛选出了若干生物活性较好的菌株（S261，S361等），表明三尖杉内生真菌物种多样性丰富，是庞大的微生物资源库；（2）菌株S361，S261的乙酸乙酯部位生物活性较好，具有丰富的化学成分；（3）分离获得2株生物活性较强、产量较高、相对稳定的内生真菌，通过柱层析对这2株内生真菌的发酵产物进行分离纯化，得到单体化合物31个，昀终鉴定出20个化合物，均与三尖杉中已报道的主要成分不同；（4）trichodermaninA,trichoderiolsAandB为新化合物，且有一定的活性，进一步表明内生真菌是重要的新药资源库。综上所述，本课题为开发应用三尖杉内生真菌及其活性产物提供了一定的理论和化学基础。三尖杉内生真菌具有良好的生物活性，有必要对其进行深入研究，从中发现结构新颖、活性较好的天然产物。关键词：三尖杉、内生真菌、分子鉴定、抗稻瘟霉、抗真菌、抗肿瘤、次生代谢产物-2-三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究AbstractEndophytesaremicroorganismssuchasfungiandbacteria(includingactinomycete)thatliveinter-and/orintra-cellularlyinsidethehealthyplanttissuescausingasymptomaticinfectionsforallorpartoftheirlifecycle.Endophyticfungihavebeeninvestigatedtohaveanti-fungal,anti-tumorandanti-oxidationactivities,andevolvewiththeplant.Researchresultsinrecentyearsshowthatendophytescanproducesomemetabolitessameorsimilartothosefromthehostplant,andmetaboliteswiththenovelstructureandspecificbioactivity.Inthestudy,Cephalotaxusfortuneiwereselectedtoisolateandidentifytheirendophyticfungi,thenscreenthebioactivestrainsandspecificmetabolitesofendophyticfungiindifferentareas.Themainresultsareasfollows:Inthepresentstudy,160isolateswereisolatedfromthebarkofCephalotaxusfortuneifromJiande.Bymeansoftheirmorphologicalcharacteristics，phylogeneticanalysisandsimilaritycomparisonofITSsequences,160isolateswereidentifiedinto16generaof14family.Then,basedonthemircodilutionmethod,20sampleendophyteswerefastscreenedbyPyriculariaoryzaeP-2bmodel,andactivitiesofendophytesagainstpathogenicfungiandtumorcellsweretested.Thus,40.0%ofendophyticfungisuppressedtheactivityofP.oryzaeP-2b.And,5colonies(25.0%)showedexcellentantifungalactivitiesagainstCandidaalbicans,Cryptococcusneoformans,TrichophytonrubrumandAspergillusfumigatuswhile4colonies(20.0%)showedexcellentantitumoractivitiesagainstMKN45,LOVO,HepG2andHL-60tumorcells.Amongthebioactivecolonies,theantifungalactivityofS361(Trichodermaatroviride)isthebest，aswellastheantitumoractivityofS261(Penicilliumsp.).FermentationbrothofS361andS261wererespectivelypreparedforisolationofmetabolites,andtheantibioticmetaboliteswereextractedwithEtOAc.Usingsilicagelandsizeexclusionchromatography,20compoundswereisolatedfromfermentationbrothofS361,amongthem,15compoundswereelucidatedbasedonspectroscopicmethods,3ofthem,trichodermaninA,trichoderiolsAandBarenewcompounds;11compoundswereisolatedfromfermentationbrothofS261,amongthem,5compoundswereelucidatedbasedonspectroscopicmethods,allofthemareknowncompounds.Activitiesof3newcompoundsagainstpathogenicfungiandtumorcellsweretested.Thus,trichodermaninAshowedexcellentanti-fungalactivitiesagainstCandidaalbicansandCryptococcusneoformans;trichoderiolsAshowedexcellentanti-fungalactivities-3-第二军医大学硕士学位论文againstCryptococcusneoformans;trichoderiolsBshowedexcellentanti-fungalactivitiesagainstCryptococcusneoformansandTrichophytonrubrum.All3compoundsshowedmoderateactivitiesagainstMKN45,LOVO,HepG2andHL-60tumorcells.Insummary,westudiedtheisolation,identificationandbioassayofendophytesfromplantCephalotaxusfortunei,theextractionandseparationoftheircomponents,andtheiractivities.Endophytesareapotentialsourceofnovelanti-microbechemistryandbiologytoassistinhelpingsolvenotonlyhumanhealth,butplantandanimalhealthproblemsalso.Indeed,itshowedthatendophyticfunguswasisolatedfromthebarkofplantCephalotaxusfortuneihaveawiderangeofanti-fungalandanti-tumoractivities.OurstudyispartofawiderprojectaimedatthepossibleexploitationoftheendophyticfungiisolatedfromplantCephalotaxusfortunei.Researchontheendophytesnotonlybringsvastsocialprofitsbutalsohasrealisticth