DNA sanger测序法原理

覃振东复旦大学生物技术中心DNA测序技术DNA测序DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸(dATPdTTPdCTPdGTP)。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。测定未知序列研究基因组多样性确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定DNA测序的发展历程（1）经典DNA测序技术70年代末，Maxam和Gilbert发明化学法、Sanger发明双脱氧终止法手动测序（同位素标记）80年代中期，出现自动测序仪（应用Sanger双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，采用计算机图象识别90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳2001年完成人类基因组框架图，全部采用基于Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。DNA测序的发展历程（2）新测序方法杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法、DNA芯片法边合成边测序法(二代测序)Maxam-Gilbert化学法测序基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。Sanger双末端终止法测序1977年，英国人FrederickSanger创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。FrederickSanger：1980年因发明测序技术获得诺贝尔化学奖基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。Sanger双末端终止法测序DNA复制是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链DNA复制双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）为测序反应的链终止剂。链终止原理Sanger双末端终止法测序流程在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。ddNTP一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸，因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。双脱氧链末端终止法测序原理示意图Sanger双末端终止法测序1．单链模板DNASanger法使用的经典测序反应是将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。2．双链模板DNA将待测的DNA片断克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片断的双链质粒，通过碱变性处理，再与寡核苷酸引物序列一起退火，然后按Sanger法进行测序。PCR产物待测模板Sanger双末端终止法测序在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。如果是PCR产物直接测序，也可以用一端的PCR引物引物Sanger双末端终止法测序测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。该酶活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。测序酶（sequenase）Sanger双末端终止法测序能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。最早采用放射性标记引物，后来采用荧光剂标记。用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。测序产物的凝胶电泳及识读基于Sanger链终止法的DNA自动化测序毛细管电泳激光测序法终止标记系统自动化测序测序流程毛细管电泳毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis,CE）是以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使荷电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。激光测序法终止标记系统激光测序法终止标记系统是用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP。测序反应可以在同一反应管内进行，不必分成4管，反应产物按终止位置的碱基不同其3′末端带有不同的荧光基团，被激发后产生不同的荧光，将反应产物加样于凝胶的同一加样孔，电泳分离后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检测将信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。自动化测序测序流程--ABI测序仪荧光标记BigDyeTerminators；美国应用生物系统公司拥有专利四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种ddNTPs，与四个反应管循环测序反应及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比，实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。由于使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPs，可按照四种不同荧光来分别识别A、T、G、C，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。自动化测序测序流程--ABI测序仪测序反应；利用测序酶和单向测序引物进行。其核心仍然是PCR反应。在测序反应体系中除了一般PCR反应所用的dNTP外，还带有BigDyeTerminators。通过反应的随机终止得到一系列含有不同荧光标记的DNA片段。自动化测序测序流程--ABI测序仪电泳与结果分析；染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，DNA序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，得到最终的测序结果。自动化测序测序流程--ABI测序仪3500Dx和3500xLDx系列基因分析仪已获中国国家食品药品监督管理局(SFDA)的批准，可以在中国用于临床诊断。Sanger测序的应用医学测序Sanger测序仍是目前基因分型的金标准。相对于其他分型技术具有最高的准确性，并能检测新的突变。真菌和细菌的检测HLA-SBT分型