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实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。1实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。2实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。颗粒在梯度中移动的快慢。取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。通过这种方法可粗略的分离叶绿体。（1）若在密度梯度介质液柱的顶端铺上一层介质溶液，在离心期间，样品的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速率，被分离成一系列的样品区带，这种离心方法称为速率区带离心。利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。密度梯度的作用一方面事支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。颗粒在梯度中移动的快慢，取决于它们的大小，形状，密度和离心力以及梯度介质的密度和粘度。主要用来分离蛋白质、RNA和核糖体这类生物大分子。用此种技术可以获得纯度相当好的亚细胞组分。（2）冻融法：把均匀的梯度液放在离心管中进行多次反复的冰冻和融化。扩散法：用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，放密度最大的梯度液于离心管底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后放置一段时间（最好放在与离心温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度放入溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。产生这种的梯级梯度的两种方法：①从最小密度层的底下铺液：准备好用相同缓冲液配制的不同浓度的梯度液。用一支有刻度的针筒，接上一根较长的平头注射针，先把一定溶剂密度最小的梯度液流入离心管底部，针头仍然插在管底，然后再把比前者密度较大一点的梯度液从最小密度层的底下慢慢地注入离心管底。由于梯度的密度关系，后者就置换了前者的位置，小密度的梯度层就向上移动。依次重复这一过程，最后就得到一种梯级梯度，其梯度的浓度从上而下逐步递增。②从最大密度层的上面铺液：先把浓度最大的梯度液放入离心管底部，然后一次把比较浓的梯度液铺在前一层高浓度梯度液的液面上。重复这一过程，直到把所有的梯度液铺完，从而形成所要求的梯级梯度。按照以上两种方法制备好梯度。梯度液一旦铺好，放在离心温度下平衡，通过扩散作用形成连续梯度。铺好的梯度管可垂直放置，也可密封好水平放置。活的连续梯度所需要的时间取决于与梯度溶质扩散速率有关的许多因素，其中包括梯度的浓度、每一梯度层的后薄、扩散期间的温度以及更重要的是溶质的分子量。3实验材料新鲜菠菜叶片。4实验器材组织捣碎机、高速冷冻离心机、Polyallomer离心管、普通离心机、普通离心管、烧杯、纱布、载玻片、荧光显微镜、剪刀、滴管。5实验药品匀浆介质（0.25mol/LTris-Hcl缓冲液pH7.4）：称取21.39g蔗糖，1.51gTris，溶解在近200ml蒸馏水中，加入约1.06ml0.1mol/LHcl,最后定容至250ml。60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。6实验步骤（1）配置蔗糖母液（浓度为60%），根据蔗糖母液的稀释表分别配置50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。（2）在Polyallomer离心管内加入50%和15%蔗糖溶液各12ml，再另一支Polyallomer离心管内依次加入60%、40%、20%、15%蔗糖溶液各6ml，注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml，加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍不同，这样密度梯度便制好了。（3）将配置好的蔗糖梯度放置在4℃的冰箱中24h。（4）24h后，洗净菠菜叶片，干燥，去除叶柄、主脉后，称取50g，剪碎。（5）加入预冷到近0℃的匀浆介质200ml，用组织捣碎机选高速档捣碎2min。（6）捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。（7）在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入5ml粗离心的样品上清液。（8）平衡离心管。（9）离心18000r/min,90min。（10）取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。7实验结果（1）叶绿体在不同密度梯度中形成的条带图，见下图。图160%、40%、20%、15%蔗糖溶液中的离心结果图2叶绿体在50%和15%蔗糖溶液中的离心结果（2）荧光显微镜下观察叶绿体图，见下图。图310倍物镜下叶绿体图图440倍物镜下叶绿体图8结果分析（1）密度梯度离心是利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成取代的方法。使用密度梯度的主要原因是这种设计能起一种稳定作用，可以消除因对流和机械震动引起区带界面的扰乱。密度梯度离心以其成本低、对核酸和蛋白质无损伤作用等特性成为目前纯化较普遍使用的方法。密度梯度离心主要有两种方法，而蔗糖密度梯度离心相较平衡密度梯度离心法有更好的优越性，所以采用葡萄糖密度梯度离心法进行对叶绿体的纯化。（2）本实验选用两种和四种浓度的蔗糖溶液制成的梯度分离收取菠菜叶绿体，结果如图1、图2。图1的管由60%、40%、20%、15%四个蔗糖浓度构成的浓度梯度，离心结果是呈深绿色的叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到60%~40%梯度交界处，形成绿色的叶绿体区带。图2中的管由50%和15%两个蔗糖浓度构成的浓度梯度的离心管，叶绿体的分布区带位置稍高于左管的叶绿体分布的区带位置。可以看出，在两管中均显示五个分离层，最上层为叶黄素层，第三层是叶绿体层，最底层是叶片的大颗粒层。（3）叶绿体中含有大量叶绿素，因为叶绿素溶液在透射光下呈绿色．而在反射光下呈红色，这种现象叫做荧光现象，所以我们制作的叶绿体装片在荧光显微镜下观察，可见红色荧光的扁圆形的叶绿体。如图3中可以看出，显微镜下的叶绿体浓度适中，能够较好的用于观察叶绿体形态。从图中可以看到明显的红色荧光，但是仍有零星的不规则或暗淡的红色亮点，那是由于此类叶绿体的形状已经有所改变。可能是由于在制片过程中，该片时用力过大将叶绿体压碎，叶绿素释放所致。9注意事项本实验中浓度梯度管的制备是实验成败的关键。在进行不同浓度灌注时一般采取依浓度梯度自大至小的顺序从离心管底向上的顺序进行，整个过程为了不破坏浓度梯度，在离心管内加不同浓度的蔗糖时必须小心，倾斜离心管沿离心管壁加，让蔗糖沿管壁慢慢流至管底或密度层。在使用移液枪时，要正确握枪，把握力度使蔗糖溶液连续滴落，如果下落的时候过于猛烈，则可能导致二者混匀，实验失败。灌注好的蔗糖梯度，竖直或水平静止过夜，其目的是让蔗糖自然形成一个过度平缓的梯度。实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量1实验目的（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量的原理。（2）掌握电泳分离胶和电泳浓缩胶的制备方法。2实验原理SDS(十二烷基硫酸钠)是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS一蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1，由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。凝胶电泳把大分子混合物分开，主要依赖于样品中各种分子携带的电荷、分子的大小与形状的差别。利用凝胶电泳测定某一物质的相对分子质量，必须排除电荷、分子形状等因素（或使其作用减少到忽略不计的程度），使该物质迁移率（泳动率）的大小仅仅取决于其相对分子质量的大小。在一定条件下，蛋白质的相对分子质量与电泳迁移率间的关系符合下列公式。lgMr=K-bm式中Mr为相对分子质量，K，b可视为常数，m称为迁移率。这样就可根据一组已知的标准蛋白质相对分子质量的对数和迁移率作图，横坐标为迁移率，纵坐标为标准蛋白质相对分子质量的对数，在半对数坐标纸上可得到标准工作曲线。将未知蛋白质在相同条件下电泳，根据它的迁移率，可在标准曲线上求得其相对分子质量。通过用已知分子量的标准蛋白做的标准曲线，通过测定样品蛋白的相对脉动率并与标准曲线比较来检测样品蛋白的分子量。目前，常用的消除电荷因素的方法，是在电泳体系中加入一定量的SDS。CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+此种阴离子表面活性剂能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使大多数蛋蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质—SDS复合物，并都携带相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带静电荷及分子的大小和形状等因素，在如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中阴离子去污剂SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。3实验用品（1）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、酸度计、电导仪、分析天平、真空泵、高速台式离心机、微量加样器、染色槽、电炉。（2）试剂：血清、盐酸、过硫酸铵、三羟甲基胺氨基甲烷（Tris）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、双丙烯酰胺（Bis）、SDS、甘氨酸、甲醇、乙酸、考马斯亮兰R-250、溴酚兰、β-巯基乙醇、冰乙酸、SDS-PAGE低分子标准蛋白。（3）试剂的配制A.凝胶贮备液（T=3%,C=2.67%）；丙烯酰胺（Acr）5.84g双丙烯酰胺（Bis）0.16g。加水至10－15ml，搅拌使溶解，定容至20ml，过滤贮于棕色瓶中。B.(2号液)浓缩胶缓冲液（0.5MTris-HclpH=6.8）三羟甲基胺氨基甲烷（Tris）0.6g。加水约5ml，用Hcl（6M）调pH至6.8后，加水定容至10ml。C.(3号液)分离胶缓冲液（1.5MTris-HclpH=8.8）三羟甲基胺氨基甲烷（Tris）1.815g。加水约6ml，用Hcl（6M）调pH至8.8后，加水定容至10ml。D.(4号液)10％SDSSDS（电泳用）1.0g；蒸馏水10ml。E.(5号液)过硫酸铵（APS）过硫酸铵100mg；蒸馏水1.0ml。临用前配制。F.(6号液）N,N,N',N'-四甲基乙二