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G蛋白偶联受体（GPCR40)演示：王杰敏回答：秦振恒论文：胡时筛选方法GPCR40简介GPCR简介•G蛋白偶联受体因能结合G蛋白并调节其生理活性而得名•其结构为七α螺旋跨膜蛋白•在信号传导与调节与多种疾病发生发展有重要关联GPCR细胞作用途径•１（1）受体-G蛋白-AC途径如配体受体复合物与Gs结合可激活AC，在Mg2+存在的条件下，活化的AC使ATP水解产生第二信使cAMP。•（2）受体-G蛋白-cAMP途径许多配体与结合后，迅速水解为两种第二信使第二信使cAMP。1）受体-G蛋白-AC途径基于该途径的药物筛选（钙离子）•方法1：荧光蛋白法•分别构建人源GPR40蛋白跨膜表达质粒：•Peakl3CD5L—hGPR40，受GPR40特异调控的ELK1激活荧光素酶报告基质粒，（1:萤光素+ATP→萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi2:萤光素化腺苷酸+O2→氧萤光素+AMP+光）•钙离子可以加速这一反应进程。第二信使钙离子检测•方法2：FLIPR钙检测试剂盒使用细胞生长过程中吸收进入细胞质的钙敏感染料，其与细胞内被释放的钙根据配体-受体作用相结合，从而产生荧光强度。FLIPR钙检测试剂盒使用细胞外屏蔽技术过滤背景荧光，提高所检测的信号强度2）受体-G蛋白-cAMP途径•（2）受体-G蛋白-cAMP途径许多配体与结合后，迅速水解为两种第二信使第二信使cAMP。检测细胞内的cAMP的含量可以筛选药物对受体结合的有效性。基于cAMP含量的药物筛选•方法一：HitHuntercAMPHS基于体外的竞争性免疫。细胞裂解液中的cAMP和ED-cAMP自由竞争抗体，与其上的β-半乳糖苷酶(ß-gal)的一个小肽片段结合。缺少游离cAMP时，ED-cAMP被抗体占据不再能被结合从而导致低信号。游离cAMP存在时，抗体位点被占据，留下ED-cAMP与EA共轭结合，活化的β-半乳糖苷酶将底物水解产生化学发光信号。阳性信号与游离cAMP结合抗体的量成比例。基于cAMP筛选二•冷光放大均相分析技术（AlphaScreen）•将活化的供体与受体颗粒覆盖上一层水膜，使其与生物分子结合，经激活，光敏供体颗粒能将空气中的氧分子转化成单线态氧，高浓度光敏供体颗粒每分钟可产生60,000个单线态氧，可起到显著的信号放大作用。结果分析(反S曲线）•使用AlphaScreen™法的Synergy2检测器对未知溶液中cAMP浓度的测定结果。一系列浓度的cAMP经试剂盒测定显示S型曲线，可以观察到AlphaScreen信号能够反映cAMP浓度。因为是一种竞争性测定，增加cAMP浓度会降低荧光信号。参考文献•【1】田源，陈璐璐，G蛋白偶联受体40／游离脂肪酸受体1的研究进展，中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2008，24(2)：399-401、416•【2】武坤，陆涛峰，武爽，关伟军G蛋白偶联受体40研究进展，遗传HEREDITAS(Beijing)2013年1月，35(1)：27—34•【3】YousefGM，DiamnadisEP．Thenewhumankallikreingenefamily：structure，function，andassociationtodisease[J]．EndoRev，2001，22(2)：184—204．•【4】ItchY，KawamataY，HaradaM，etal．FreefattyacidsregulateinsulinsecretinofrompancreaticbetacellsthroughGPR40．Nature，2003，422：173一176．•【5】BrisneeCP．TadaynynM，AndrewsJL，etal．TheorphnaGproteincoupledreceptorGPR40isactivatedbymediumandlong-chainfattycaids．JBiolChem，2003，278：11303一11311．•【6】KotarskyK，NilssonNE，FlodgrenE，etal．Ahumancellsurfacereceptoractivatedbyfreefattyacidsandthiazolidinedionedrugs．BicehemBiophysRseCommun，2003，301：406_410．•【7】TomitaT，MasuzakiH，NoguchiM，etal．GPR40geneexperssioninhumanpancresasandinsulillonla．BiochemBiophysResCommum，2005，338：1788-1790．•【8】吴华，谷卫，G蛋白偶联受体40的研究进展，国际内分泌代谢杂志2007年3月卷第2期•【9】Rodriguez-LoapzAM，Martinez-SalgadoC，ElenoN，eta1．Nitricoxideis•involvdeinapoptosisinducedbythapsigargininratmesangialcells．Cell•PhysiolBicehem，1999，9：285-296．•【10】YamaguchiH，BhallaK，WangHG．Baxplaysapivotalroleinthapsigar-gin-inducdeapoptosisofhumancoloncancerHCT116cellsbycontrollingSmac／DiabloandOmi／HtrA2releasefrommitochendria．CanecrRse．2003．63：1483．1489．•【11】ShimokeK，KishiS，UtsumiT，eta1．NGF-inducedphosphatidylinositol3-kniasesignalingpathwaypreventsthapsigargin-triggeredERstress-me-diatedapoptosisinPC12cells．NeurosciLett，2005，389：124-128．•【12】殷承慧,胡又佳，针对G蛋白偶联受体的药物筛选新方法，综述评论2010年第31卷第2期。•【13】高丽辉，环奕，刘景龙，刘泉，申竹芳，以GPR40受体为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型的建立，中国药理通讯2010年第二十七卷第二期•【14】FLIPRCalciumAssayKits，•【15】FluoForte®Calciumassaykitformicroplates•【16】HitHunter™CAMPHSAssayWithMithrasLB940，•【17】AlphaScreen™：使用Synergy2多功能酶标仪进行cAMP定量分析，!ECUST