胶回收试剂盒说明书(生工)

SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒产品编号：SK8131/SK8132包装规格：50次/100次试剂盒组成组分SK8131，50次SK8132，100次纯化套件（吸附柱+收集管）50套100套BufferB230ml60mlWashSolution12ml24mlElutionBuffer5ml10ml操作手册1份1份保存方法及注意事项本试剂盒在室温（15~25°C）干燥保存，有效期见包装。BufferB2中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。产品介绍本试剂盒适用于从TAE和TBE琼脂糖凝胶中回收100bp~10kb的DNA片段，回收效率可达80%。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除其他杂质，得到高质量的DNA回收产物。本试剂盒采用的膜结合液中不含有干扰酶活性的碘化钠，所得到的DNA可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点：1.适用范围广，回收效率高，对于100bp~10kb之间的DNA片段回收效率在80%以上。2.操作简单快速，整个回收过程仅须15分钟左右。3.洗脱效率高，洗脱体积最小可低至15µl。快速操作流程（胶回收）1.准备工作。a.检查WashSolution中是否已经加入乙醇。b.检查BufferB2是否出现沉淀。c.将水浴锅调至55°C。2.从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重。3.加入胶块重量3-6倍的BufferB2，50°C水浴5-10分钟溶胶。4.（选做）对于500bp的片段，加入1/3BufferB2体积的异丙醇。5.将溶胶液移入吸附柱中，8,000×g离心30秒。倒掉收集管中液体。6.加入500μlWashSolution，9,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。7.重复步骤6一次。8.空吸附柱于9,000×g离心1分钟。9.将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μlElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。溶胶上柱洗涤洗脱试剂准备1.自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力≥12,000×g）、1.5ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。2.按瓶身标签说明在WashSolution中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为80%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。3.BufferB2在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37°C溶解沉淀，待冷却至室温后使用。4.提前将水浴锅调至55°C备用。标准回收步骤1.通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。尽可能多地去掉不含目标DNA的琼脂糖。每管琼脂糖凝胶块不要超过400mg，否则导致溶胶不完全。切胶过程尽可能快，减少DNA在紫外线中的暴露时间以降低对DNA的损伤。2.根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300~600µl的比例加入BufferB2。凝胶浓度≤1%，每100mg凝胶加入300µlBufferB2；凝胶浓度1%，≤1.5%，每100mg凝胶加入400µlBufferB2；凝胶浓度1.5%，≤2%，每100mg凝胶加入500µlBufferB2；凝胶浓度2%，每100mg凝胶加入600µlBufferB2。3.将离心管置于50°C水浴5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。胶块完全溶化即可，过长时间的处理可能导致DNA损伤。4.（可选步骤）当目的片段500bp时，加入所使用的BufferB2体积1/3的异丙醇，混匀。当目的片段≥500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。5.将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果溶胶液总体积大于750µl，则每次使用750µl，多次上柱。6.向吸附柱中加入500μlWashSolution，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。WashSolution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。7.重复步骤6一次。8.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min。此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。9.在吸附膜中央加入15~40μlElutionBuffer，室温静置1~2min，9,000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20°C保存或用于后续试验。ElutionBuffer为2.5mMTris-HCl，pH8.5，可以用TE或水（pH7.0）代替。将ElutionBuffer预热至60°C可以进一步提高得率。如果片段4kb，在37~60°C温浴2分钟可以显著提高得率。请勿使用小于15μl的洗脱液进行洗脱。常见问题解答1.DNA回收效率较低或者未回收到目的片段a.胶块溶解不完全。可适当延长水浴的时间，并增加颠倒混匀的频率辅助溶解。b.胶块体积太大，溶胶困难。可先将胶块切碎，溶胶后分多次上柱离心，回收DNA片段。c.漂洗液中未加入正确量的无水乙醇。d.Agarose抑制DNA与吸附材料的结合。应尽量切除不含目的DNA片段的Agarose胶。e.提高BufferB2的相对浓度，增加DNA与吸附膜的作用时间（静置时间），在一定程度上可以提高回收率。f.如果纯化的片段长度大于4kb或者目的片段含量较少，可以将洗脱液再次加入至吸附柱中进行洗脱，以提高回收效率。g.洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。h.洗脱液不合适。洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其pH值7.0，pH值过低可能导致低洗脱效率。i.洗脱时间过短。洗脱时放置1分钟可达到较好的洗脱效果。洗脱时将洗脱液预热至60°C后使用，有利于提高洗脱效率。2.回收DNA进行后续酶切反应效率低a.洗脱产物中含有残留的乙醇。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥2-5分钟，有助于残留的酒精挥发完全。b.盐份的残留。请确保使用WashSolution洗涤两次，每次500µl沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。c.琼脂糖质量差。请选用高质量的琼脂糖。3.琼脂糖凝胶胶块不溶a.琼脂糖质量差。请选用高质量的琼脂糖。b.含目的片段的胶块在空气中放置时间过长，使胶块失水、干燥。建议切胶后立即进行胶回收，或将胶块保存在4°C或-20°C备用。c.配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。应重新配制缓冲液。4.洗脱液的选择洗脱液可以根据后续实验的需要来确定。一般情况下，若需要进行测序反应，请用双蒸水洗。