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1.用接种环在LB无抗固体平板上划线培养冻存的GV3101菌种，培养约36小时后挑取单克隆接种至5ml的LB液体培养基中，在28℃于200rpm培养过夜；2.按照1:100的比例将新鲜培养的农杆菌接到100mlLB液体培养基中，继续培养大约4-5小时至对数生长期(OD600=0.5-1.0)；3.将培养好的菌液置冰上冷却5-10min，若此时不急于制作感受态菌种，可将菌液置4℃放置几小时；4.在制作感受态前，将所有实验中与菌体接触的离心管，EP管，枪头，溶液等冷却；5.将菌液倒入冷却好的大离心管中，平衡后于4000rpm，4℃离心10min；6.弃掉上清，在无菌滤纸上倒置约30s，然后用5ml冰预冷的20mMCaCl2轻柔悬浮细菌，平衡后于4000rpm，4℃离心10min；7.弃掉上清，在无菌滤纸上倒置约10s，然后用1ml冰预冷的20mMCaCl2轻柔悬浮细菌；8.将制作好的感受态细胞以100ul的体积分装于预冷好的1.5ml无菌EP管中，迅速在液氮中冷却，置-80℃保存。