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琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.AGelExtractionKit适合于D2501-**,D2500-**&D2502-**准备工作1.浓缩的SPWBuffer需用乙醇按如下稀释:D2500-00&D2501-00&D2502-00加入20ml100%的乙醇;D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02每瓶加入100ml100%的乙醇;注意:稀释后的DNAWashBuffer需室温保存;所有步骤必须在室温下进行.操作方案配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段.任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量;2.电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来.并尽量去除多余的凝胶.注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜.3.称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积.一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3分钟混匀一次;重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-BindingBuffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混合物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5μl浓度为5M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.一般情况下,使用新鲜的电泳缓冲液,凝胶-Bindingbuffer混合物的PH值的不会升高;4.转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000×g离心1min,弃去液体.一个HiBindDNA柱子最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μgDNA.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中.5.将柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键,不要忽略此步.6.将柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;注:SPWWashbuffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释.7.将柱子重新套回收集管中,重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,弃去滤出液;,将空柱子重新套回收集管中,10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体.这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的.8.把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10,000×g离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度.如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.DNA的产量及质量:把纯化产物的样品稀释一定的倍数后,分别在260nm和280nm下测其光吸收值,回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算:DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量.而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率.(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记.如果此值1.8,则意味着核酸的纯度90%.另一方面,如果纯化产物的产量较低时,可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度.载体