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Agilent1200制备液相色谱现场培训手册捷伦科技有限公司生命科学与化学分析仪器部培训目的•基本了解1200制备液相色谱硬件构成•了解制备液相色谱原理•掌握化学工作站中关于制备液相色谱部分的参数设定，馏分收集，数据分析等操作培训准备一．仪器设备：Agilent1200制备液相色谱•分析级制备液相色谱G1322A（脱气机）；G1379B（微池脱气机）G1310A（单元泵）；G1312A，G1312B（二元泵）；G1311A（四元泵）G1329A（标准型自动进样器）；G1367A（微盘自动进样器）G1316A，G1316B（柱温箱）G1314B，G1314C（可变波长紫外检测器）G1315C，G1315D（二极管阵列检测器）G1365C，G1365D（多波长检测器）G1364C（分析级馏分收集器）•制备级制备液相色谱G1361A（制备泵）；G1391A（双制备泵，供梯度进样用）G2260A（标准制备型自动进样器）G2258A（双环自动进样器，可兼作分析/制备使用）G1383A（制备柱挂架）G1315C，G1315D（二极管阵列检测器，配合制备级流通池使用）G1365C，G1365D（多波长检测器，配合制备级流通池使用）G1364B（制备级型馏分收集器）二．色谱柱：•分析级制备液相色谱ZorbaxEclipseXDB-C18150X4.6,5umcolumn)orequivalentP/N993967-902/5063-6600•制备级制备液相色谱ZORBAXSB-C18,50mmx9.46mm(846975-202)orequivalent三．溶剂及调试用样品准备：•色谱级纯度乙腈或者甲醇•二次蒸馏纯水•延迟体积校正用染料样品（G1946-85020）•LC用调试样品(01080-68704)注：本手册内涵盖的内容为制备液相模块的内容，其他模块如分析级泵，分析级自动进样器，柱温箱等，请参看安捷伦1200液相色谱现场培训手册等制备液相色谱原理一．什么是制备液相色谱？制备液相这一术语通常是和大容量色谱柱、高流速联系在一起的。但制备液相，并不取决于仪器的大小或流经系统流动相的多少，而是由分离目的决定的。分析液相的目标是对化合物进行定性和定量测定。而制备液相则是对珍贵产物进行分离和纯化(表1)。由于制备液相与蒸馏、结晶或提取等传统纯化方法相比是一项相当昂贵的技术，所以它只在稀有或珍贵的产品上。药物活性、毒性及筛选试验需要不同量的高纯度化合物，随着这些需求的增加，制备液相领域正在发生变化。分析液相制备液相样品从检测器进入废液瓶样品从检测器进入馏分收集器目的：化合物定量和/或定性目的：化合物的分离和/或纯化低流速(5ml/min)比较小的柱径(5mm)高流速(5ml/min)比较大的柱径(5mm)表1分析液相和制备液相的定义二．制备液相色谱的应用范围制备液相用于化工、制药，以及生物技术和生化中珍贵产品的分离和纯化。根据应用范围不同，要分离或纯化的化合物量有很大区别。生物技术中的酶分离是从ug水平开始的，这种制备规模我们称为微量纯化。合成或天然产物化学中未知化合物的鉴定或结构解析，需要获得1到几毫克的纯化合物。制备标准品、毒理和药理试验的对照化合物，则需要克级的更大量。工业规模或生产规模的制备液相能达到kg级的制备量，目前主要用于贵重药品的生产。表2总结了制备液相的应用范围。化合物量应用范围ug•酶的分离mg•生物和生化试验•以下化合物的结构解析和鉴定：-合成的副产物-生物基质中的代谢物-天然产物g•对照化合物(分析标准品)•毒理监测化合物-高纯度的主要成分-副产物的分离kg工业规模、活性化合物、药物表2制备液相的应用范围制备液相色谱方法建立和按照比例放大计算在分析色谱中，加到色谱柱上的样品量一般是μg水平，也可以更少。化合物和固定相的质量比低于1:100000。所加样品的体积通常也远远小于柱体积(1:100)。在这种条件下，才能得到尖锐而对称的良好峰形。而制备液相最大差异就是固定相上的上样量要高得多。下面将详细讨论对色谱分离的影响、进样更大量样品的方法以及分析方法的放大。一．吸附等温线分析液相的目的是对化合物进行定量和/或定性测定。获得可靠、准确结果的重要色谱参数是分离度、峰宽和峰的对称性。如果把越来越多的样品加载到柱子上，峰高和峰面积将增大，而峰对称性和容量因子则保持不变，如图1所示。图1分析液相的峰形分析液相的理想峰形类似于高斯(Gaussian)曲线。用峰的标准偏差σV描述其对称性及与高斯曲线的近似度。容量因子(k’)是保留时间(t)与不保留化合物保留时间(t0)之比。如果超过一定量的样品被注入到色谱柱上，吸附等温线将不呈线性。即峰形将不对称，表现为明显拖尾、容量因子降低(如图2所示)。在制备液相中，这种现象称为浓度超载。某些情况下，由于化合物不同，随着超载增加会出现容量因子增大的现象，将导致严重的前伸峰。由于吸附等温线取决于化合物，所以每个制备液相实验都要确定色谱系统的柱载荷率。图2制备液相的容量因子和色谱峰标准偏差二．色谱柱的装载和超载纯化大量样品可以有两种方法：分析系统的按比例放大或柱超载分析系统按比例放大就是使用更大内径的色谱柱、更高的流速，根据柱长增大进样体积，但样品浓度保持不变。色谱峰将保持尖锐和对称。这种方法的缺点是，分离相当少量的样品也要用大色谱柱和大体积溶剂，因此，这种方法并不经济。而色谱柱超载，则是在同样的分析条件下增加上样量，通常选择的是这种方法。用柱超载的方法即使在分析柱上也可以分离毫克级的样品。要制备更大量的样品，可以在此基础上再按比例放大。柱超载可以以两种方式实现浓度或体积超载。浓度超载中，样品的浓度增加了，但进样体积还保持不变。容量因子k‘增大，峰形从高斯曲线变为三角形(如图3所示)。只有当样品在流动相中有很好的溶解度时才能进行浓度超载。图3体积和浓度超载的峰形如果化合物的溶解度较差，则不能采用浓度超载，只能进样更大的样品体积。这种技术称为体积超载。超过一定进样体积后，峰高将不再增加，色谱峰将变得更宽，并呈矩形。在制备液相中，浓度超载比体积超载更好，因为能分离的样品量更大。由于化合物的溶解度通常是一个限制因素，所以两种超载技术可以结合使用。表3对两种超载技术进行了概括总结。浓度超载体积超载•由化合物在流动相中的溶解度决定•由进样体积决定•吸附等温线的“制备”区域•吸附等温线的“分析”区域•制备量由选择性决定•制备量由柱内径决定•固定相的粒径影响较小•需要小粒径的填料表3浓度和体积超载的概要三．方法放大浓度超载和体积超载都将导致化合物分离度的降低。由于化合物分离需要一定的分离度，所以在开发分析方法时优化分离度非常重要(图4)。选择性和超载的可能性相互依赖，改善选择性将增加一次运行能够分离的样品量。因此，将分析方法优化并放大到制备方法分为三个步骤：1.优化分析方法的分离度2.在分析柱上进行柱超载3.放大到制备柱图4色谱分离度方程四．按比例放大的计算图5放大计算方程使用图5中的方程计算放大量，显示的例子是，3mm内径柱上0.6mL/min的流速放大到21.2mm内径柱上。使用下面的方程计算加载到色谱柱上的化合物量，用在放大浓度或进样体积的计算上都没有区别。如果两根柱子的长度相同，则因子CL等于1。进行了放大计算和第一次制备分离后，要得到最好的分离结果，还可以进一步优化参数5。五．制备液相的目标有三个重要参数来衡量制备分离的效果，它们是产物的纯度、产率和通量。由于这些参数彼此依赖，所以不可能从所有这三个方面来优化一个制备液相方法(图6)。图6制备液相分离的结果色谱图1所显示的制备液相分离能有非常高的通量，但两个化合物分离得不好。每个化合物都可能得到一些高纯度的产物，但是回收率，即产率却相当低。色谱图2中各个峰都得到了良好分离，两个化合物的纯度和产率都很高，但是通量却非常低。色谱图3是优化的制备液相结果，对所有三个参数进行了平衡考虑。色谱峰基本上达到了基线分离，得到了较高纯度和产率，通量也尽可能大。优化分离的最重要参数应当由具体应用来决定。例如，如果是为进行活性或毒性试验而进行的分离，需要得到高纯度的化合物。通量和产率则不很重要。如果要纯化的是合成中间体，纯度将不是最重要的考虑，只要能满足下一步合成即可。但这时重要的是通量，因为它是尽快完成整个合成所必须的。产率也很重要，因为化合物很贵重，损失应减至最小。注：以上章节部分摘自安捷伦科技有限公司出版的《制备液相原理》，您也可以点击以下图标，查阅完整版本，更好的理解和运用制备液相的理论基础知识制备相关液相硬件介绍(除分析液相模块之外)分析级馏分收集器G1364C最大流速：5ml/min备注：可以添加G1330A/B温控模块精确控制馏分收集温度随机带40位2ml样品盘和15位6ml样品盘制备泵G1361A最大流速:100ml/min梯度洗脱双制备泵G1391A最大流速：100ml/min备注：即两台G1361A泵联机工作，提供梯度洗脱功能制备级标准自动进样器G2260A最大进样量:900µl备注：可以另购多次进样包和扩充针座毛细管，以达到最大5000µl的进样量双环自动进样器G2258A最大进样量：5000µl备注：可以添加G1330B温控模块精确控制进样温度配备制备/分析级两个进样环，分别负责制备级别的进样和分析级别的进样柱挂架G1383A多波长检测器G1365C/D不同尺寸流通池，配合从分析－制备级别的使用10mm#183mm#220.3mm#240.06mm#26二极管阵列检测器G1315C/D不同尺寸流通池，配合从分析－制备级别的使用10mm#183mm#220.3mm#240.06mm#26制备级手动进样器阀型号3725i制备级馏分收集器G1364B备注：可以添加G1330A/B温控模块精确控制馏分收集温度随机带40位2ml样品盘和15位6ml样品盘基本操作步骤一．正确的模块连接•分析型制备液相色谱所有管线均为绿色0.13mmID管线馏分收集器管线为随机带的0.25mmID管线•制备级制备液相色谱1.所有管线均为0.5mmID管线2.若配置双环自动进样器，则进样器入口管线为0.5mmID，出口至柱子管线为0.253.馏分收集器管线为随机带的0.8mmID管线注意制备柱挂置方向为从下朝上二．准备工作•检查溶剂柜内的流动相•检查容机柜内的柱塞杆清洗溶剂（10％异丙醇水溶液）•打开流动相瓶至泵输液管线上的红色开关保证流路通畅•检查废液出口管线及废液瓶，由于制备液相流速较大，建议使用较大的废液瓶，并及时观察，防止废液溢出三.开机通讯•打开计算机,进入WindowsXP画面。（IP地址由BootpService程序写入）•打开1200LC各模块电源。•待各模块自检完成后（注：双环自动进样器，馏分收集器开机后需若干分钟才能完成全部自检工作，期间请耐心等待），双击“Instrument1Online”图标，化学工作站启动并联通与1200液相色谱的通讯，进入的工作站画面如下所示。五部分工作界面•左侧导航菜单中显示化学工作站有五个工作界面，分别是-Methodandruncontrol（方法，参数设定及运行的控制界面）-Dataanalysis（数据处理界面）-Reportlayout（报告格式编辑界面）-OQ/PV（系统认证界面）-Diagnosis（仪器维护及诊断界面）•请选择第一部分MethodandRuncontrol，进入仪器各部分参数设定界面四.制备泵的配置和工作参数设定（G1361A）1.制备泵的配置设定•冲洗以及主动柱塞杆清洗功能设定（以双制备泵配置为例）－分析级1200液相色谱泵单元上的手动冲洗阀，被电磁冲洗阀（EMPV）所取代电磁冲洗阀－运行方法之前请冲洗泵头，以杜绝气泡等因素对泵压的影响－点击“制备泵”图标，点击“setupupgradient”选项，进入泵参数编辑画面－确认右上角“purge（solventA）被激活（enable被选中），并保证流速设定为0ml/min点中enabled－点击“制备泵”图标，点击“contro