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1．2基因工程的基本操作程序课程标准概述基因工程的基本操作程序。课标解读1.通过比较、分析，掌握目的基因获取的常见方法。2.理解目的基因导入受体细胞的具体过程。3.结合基因的表达过程，掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。1．基因工程的基本操作程序(1)的获取。(2)的构建。(3)将目的基因导入。(4)目的基因的。目的基因的获取目的基因基因表达载体受体细胞检测与鉴定2．目的基因的获取(1)目的基因：主要是指的基因，也可以是一些具有的因子。(2)常见方法：①从基因文库中获取基因文库的种类编码蛋白质调控作用部分基因文库如基因组文库cDNA文库②利用PCR技术扩增目的基因a．原理：。b．条件：、DNA模板、、四种脱氧核苷酸。c．过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，与单链相应互补序列结合，然后在作用下进行延伸，如此重复循环多次。d．结果：每一次循环后，目的基因的量可以，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。③人工合成法：如基因比较小，又已知，可借助用化学方法直接人工合成。DNA双链复制引物Taq酶引物DNA聚合酶增加一倍核苷酸序列DNA合成仪[思维激活1]PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？提示PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。1．提取目的基因方法的比较方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)过程供体细胞中的DNA限制酶许多DNA片段连接表达载体导入受体细胞外源DNA扩增，产生特定性状分离目的基因目的基因的mRNA反转录单链DNA合成双链DNA插入载体导入受体菌群(cDNA文库)分离目的基因目的基因DNA高温解链单链DNA与引物结合、DNA聚合酶大量目的基因蛋白质的氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因优点操作简单专一性可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度、技术要求高适用范围小2．PCR技术与DNA复制的比较比较项目DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪中)酶解旋酶、DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需90℃～95℃高温结果合成DNA分子合成DNA片段或基因联系(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸特别提醒(1)真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子，因此，不能直接用于基因的扩增和表达。获得真核细胞中目的基因时，一般用人工合成的方法。(2)PCR扩增的过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应的互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一培，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。【巩固1】下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()。①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．①②④D．②③解析PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①、④则均不需要模板。答案D1．基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成①启动子位置：基因的首端。功能：是识别和结合的部位，驱动基因转录出。基因表达载体的构建与转化RNA聚合酶mRNA②终止子位置：基因的尾端。功能：使在所需要的地方停止下来。③标记基因：鉴别受体细胞中是否含有。(2)基因表达载体的功能使目的基因在受体细胞中，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够和发挥作用。(3)基因表达载体的构建一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。转录目的基因稳定存在表达2．将目的基因导入受体细胞(1)转化的概念目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。(2)将目的基因导入植物细胞①法：将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。②法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。③法：我国科学家独创的一种方法。维持稳定和表达农杆菌转化基因枪花粉管通道(3)将目的基因导入动物细胞方法：法。常用受体细胞：。(4)将目的基因导入微生物细胞第一步：首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为细胞。第二步：将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收，完成转化过程。显微注射受精卵感受态DNA分子[思维激活2]为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？提示微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点，因此是基因工程常用的受体细胞。1．基因表达载体的构建步骤(1)一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的末端。(2)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程(如下图)。2．将目的基因导入受体细胞的方法比较细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→通过农杆菌→进入植物细胞→插入到植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物植物细胞基因枪法目的基因包裹在微小的金粒或钨粒表面→用基因枪高速射入到受体细胞或组织中→目的基因表达成本较高，是单子叶植物中常用的基因转化方法花粉管通道法含目的基因的溶液→滴加在柱头上(或用含目的基因的溶液处理花粉粒)→花粉粒吸入目的基因→授粉→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创动物细胞显微注射法目的基因片段→受精卵的核内→受精卵经胚胎早期培养一般时间后移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使其发育成转基因动物最为有效地将目的基因导入动物细胞的方法微生物细胞感受态细胞Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体在缓冲液中与感受态细胞混合→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效特别提醒(1)基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。(2)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞，但常用体细胞。(3)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵。受精卵作为受体细胞具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。而动物体细胞的全能性受限。【巩固2】请据图回答下列问题。(1)基因工程的核心步骤是_________________________。(2)利用________技术可以获得大量的目的基因。该技术利用________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈指数增长。(3)图中________位于目的基因的首端，是________识别和结合的部位。抗生素抗性基因的作用是作为________，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因。解析本题考查基因表达载体的组成及其构建。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；目的基因的获取方法很多，其中PCR技术能迅速获得大量目的基因，其依据的原理是DNA双链复制原理；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、终止子，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录为mRNA，抗生素抗性基因作为标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。答案(1)基因表达载体的构建(2)PCRDNA双链复制(3)启动子RNA聚合酶标记基因1．分子检测(1)检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。①方法：技术(DNA探针＋转基因生物)。②结果：如果显示出杂交带，就表明目的基因。(2)检测目的基因是否转录①方法：技术(DNA探针＋转基因生物)。②结果：如果显示出杂交带，则表明目的基因。目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交DNA已插入染色体DNA中分子杂交mRNA转录出了mRNA(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法：。②结果：若有杂交带出现，则表明目的基因。2．个体水平鉴定包括抗虫、抗病的实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。抗原—抗体杂交已形成蛋白质产品接种[思维激活3]进行目的基因导入及转录检测时，均用到DNA探针，该探针的脱氧核苷酸序列如何？其检测依据是什么？提示把“目的基因片段”进行放射性同位素标记或进行荧光标记，用标记好的基因片段做探针，与受体生物的基因组DNA进行杂交，如果有杂交带出现，根据分子杂交的基本原理，说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性，也就是说目的基因已经被导入受体细胞内，反之，则说明目的基因没有进入受体细胞中。目的基因导入受体细胞的结果分析说明：上图中发生②与发生①相比，②会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而①细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。【巩固3】目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()。①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录mRNA④检测目的基因是否翻译蛋白质A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④解析目的基因的检测包括：首先检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交；其次检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。答案C【例1】水稻种子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。目的基因的获取据图回答下面的问题。(1)图中基因组文库______(填“小于”“等于”“大于”)cDNA文库。(2)B过程需要的酶是___________________________________；A、C过程中________(填“可以”“不可以”)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中________和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_____________________________________。思维导图：深度剖析基因组文库包含本物种全部遗传信息，cDNA文库仅包含部分遗传信息；由mRNA构建cDNA文库需逆转录酶，筛选目的基因时，可用同一种探针对由基因组文库或cDNA文库中获取的目的基因予以检测，若通过PCR技术扩增目的基因，可利用DNA或cDNA作为模板，该扩增过程需耐高温的DNA聚合酶参与。答案(1)大于(2)逆转录酶可以(3)DNAcDNA耐高温【例2】α1抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。基因表达载体的构建与转化下列关于该过程的叙述中错误的是()。A．载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞B．将目的基因导入羊膀胱细胞中，将会更加容易得到α1抗胰蛋白酶C．培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产