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第3章临床微生物学检验技术一、细菌形态学检验（一）制片1.涂片取洁净载玻片一张，用标记笔一分为二，用接种环取生理盐水2环，分别置于玻片两端，接种环灭菌后，取金黄色葡萄球菌斜面培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。接种环灭菌后以同样方法再取大肠埃希菌少许，与另一端生理盐水混匀后涂成均匀薄膜。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。2.干燥涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。3.固定涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。固定目的：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。涂片干燥固定染色镜检（二）革兰染色法1.原理（1）革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。（2）革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。（3）革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。2.染色方法（1）标本涂片、干燥和固定。（2）染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴，室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。（3）标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后用油镜观察。3.结果紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。（二）抗酸染色1.原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。2.方法（1）萋纳石炭酸复红染色，加温促使菌体着色5min；（2）流水冲洗，3%盐酸酒精脱色1~3min；（3）吕氏美蓝复染30s。3.结果未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌,脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。（三）鞭毛染色1.原理细菌的鞭毛能被碱性复红酒精饱和溶液着色，是因为在染色过程中随着酒精的蒸发其染料沉积在鞭毛上，使鞭毛着色。碱性复红作为主要染料，而丹宁酸为媒染剂。2.方法（1）采用点种法接种的变形杆菌（或其他鞭毛菌），近离接种点的菌，鞭毛细，菌体较短；远离接种点的菌，鞭毛粗，菌体长，用无菌接种环取远离接种点的菌混悬于盛有无菌蒸溜水的平皿内，不要研磨以免鞭毛脱落，置室温放置10～15min，使鞭毛膨大。（2）用毛细滴管将菌液滴于洁净的玻片上，缓慢倾斜玻片任菌液流开，始之成为均匀薄膜，将玻片置37℃温箱内，任其自然干燥，切勿用火焰固定。（3）在干燥标本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆盖于薄膜上，作用1～2min后轻轻用水冲，干后镜检观察。3.结果菌体染成红色（或深紫色），鞭毛染成淡红色（或淡紫色），染色时间越长，鞭毛越粗。（四）荚膜染色1.原理荚膜为细菌细胞壁外围的黏液层，对染料的亲和力很低，用一般染色不易着色，必须通过荚膜染色方法或衬托染色，方能清晰辨认出荚膜。2.方法用有荚膜的细菌培养物涂片，火焰固定，固定标本后加1%结晶紫染液，室温保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸铜水溶液冲洗染液，勿水洗。待干后镜检观察。3.结果菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。二、培养接种（一）划线接种1.方法斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法。斜线法曲线法方格法放射法四格法（二）培养基血平板巧克力血平板伊红美蓝平板麦康凯平板SS平板M-H平板三、生化反应（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时后，观察结果;若用微量发酵管，或要求培养时间较长时。结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(O-F试验）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种1支HL培养管中，从培养基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。结果：培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。1为产碱型2为氧化型3为发酵型应用：主要用于肠杆菌科与其他非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。3．甲基红（MR）试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。4．Β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。5．VP试验原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml400g/LKOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。6．胆汁七叶苷水解试验原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观察结果。结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。应用：主要用于鉴别肠球菌与其他链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。肠球菌本试验为阳性。（二）细菌对于蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d，逐日观察结果。若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4℃冰箱内30min，再看结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。阴性阳性2.吲哚（靛基质）试验原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。培养基：蛋白胨水培养基。方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。培养基：醋酸铅培养基。方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48h观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。4.尿素分解试验原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。培养基：尿素培养基。方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养18～24h观察结果。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。阳性阴性阴性5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养18～24h，滴加10％三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。加氯化铁试剂出现绿色为阳性应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。6.氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35℃培养1～4d，每日观察结果。结果：孵育后，对照管应呈黄色，测定管呈紫色（