第7章球菌球菌(cocci)•菌体形态为球形的一类细菌。临床上通常引起化脓性感染,又称化脓性球菌(pyogeniccocci)。•与医学有关的革兰阳性兼性厌氧球菌有9属。本章主要介绍临床最常见的兼性厌氧球菌,包括葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属。•革兰阴性球菌主要包括奈瑟菌属(Neisseria)和莫拉菌属(Moraxella)。第一节葡萄球菌属•葡萄球菌属(Staphylococcus)在自然界广泛分布。存在于人和动物的皮肤黏膜上的菌株可致多种化脓性感染,如疖、痈、脓肿、菌血症等,还可引起烫伤样皮肤综合征和毒性休克综合征等疾病。葡萄球菌属•目前有35个种、17个亚种,引起人类疾病的重要菌有金黄色葡萄球菌(S.aureus),表皮葡萄球菌(S.epidermidis),头状葡萄球菌(S.capitis),人葡萄球菌(S.hominis)等。•临床常以是否产生凝固酶分为凝固酶阳性和凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulasenegativestaphylococcus,CNS)。•根据噬菌体分型,可分成4~5群26型。•利用质粒大小分型、血清学分型、抗生素分型和细菌DNA的RFLP或PFGE分型,用来研究细菌的致病性、耐药性、流行病学特点和细菌鉴别的关系。•该属细菌DNAG+Cmol%为30%~39%。二、临床意义•(一)致病因素•1.酶类(1)凝固酶(2)耐热核酸酶(3)透明质酸酶、磷脂酶•2.毒素(1)葡萄球菌溶素(2)肠毒素(3)毒性休克综合征毒素(4)杀白细胞素(5)表皮剥脱毒素(1)凝固酶•葡萄球菌属产生2种血浆凝固酶:•结合凝固酶或聚集因子,是结合在菌体表面的凝固酶,能与血浆中的纤维蛋白原交联使菌体快速凝集;•游离凝固酶,是细菌分泌到菌体外的凝固酶,能被血浆中的协同因子(cofactor)激活形成复合物,再使纤维蛋白原转变成纤维蛋白,而使血浆凝固;保护病原菌不被吞噬或免受抗体等的作用。(二)所致疾病•1.化脓性疾病–1)皮肤化脓性感染–2)各种器官的化脓性感染–3)全身感染•2.毒素性疾病–1)食物中毒–2)烫伤样皮肤综合征–3)毒素性休克综合征(TSS)–4)假膜性肠炎•3.医院感染三、微生物学检验•(一)葡萄球菌的基本特性•1.形态结构2.抗原成分•1.葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalproteinA,SPA)–位于菌体表面,存在于菌细胞壁的一种表面蛋白。可与IgG的Fc段结合,应用于协同凝集试验。–A蛋白有抗吞噬作用,还有激活补体替代途等活性。是完全抗原,具属特异性。•2.多糖抗原–具有群特异性,细胞壁中的磷壁酸包含的N-乙酰葡胺核糖醇残基为A群多糖抗原;N-乙酰区糖胺甘油残基为B群多糖抗原。•3.荚膜抗原–几乎所有金黄色葡萄球菌菌株的表面有荚膜多糖抗原的存在。表皮葡萄球菌仅个别菌株有此抗原。3.变异性•(1)细菌细胞壁缺陷型–受抑制破坏细胞壁药物或外界因素作用,可以形成细胞壁缺陷型细菌,在高渗环境中生存。•(2)耐药性变异–部分菌株通过获得外源性的mecA而产生青霉素结合蛋白2a(PBP2a),导致对所有β内酰胺类抗生素耐药。4.培养特性•兼性厌氧菌,有氧条件下生长较厌氧条件迅速和旺盛•对营养要求不高,最适生长温度35~37℃,最适pH7.4~7.6。•普通培养基上形成直径2~3mm不透明的圆形凸起菌落。产生金黄色、白色、柠檬色等非水溶性色素附着在菌落上。•金黄色葡萄球菌–血琼脂平板上菌落周围有透明溶血环–能在含10%~15%NaCl琼脂中生长–甘露醇高盐平板上为黄色菌落。5.抵抗力•该菌的抵抗力比其他无芽胞细菌强,耐干燥;近年来耐药性增强,对多种抗菌药物不敏感。葡萄球菌内携带诱导性的青霉素酶和乙酰基转移酶质粒,通过转导进行质粒的转移。(二)葡萄球菌的临床检验程序•标本采集:根据感染的部位,采集不同的标本。该属细菌广泛分布在人体皮肤和黏膜,采取时避免病灶周围正常菌群污染。标本直接检查•显微镜检查无菌体液如脑脊液和关节穿刺液等可直接涂片、革兰染色后,显微镜检查见类似葡萄球菌的革兰阳性球菌,则具有重要临床价值;其他体液标本查见细菌的同时伴有炎性细胞则也具有参考价值。可初步报告“查见类似葡萄球菌属革兰阳性球菌”,并进一步进行分离和鉴定。•抗原检测乳胶凝集试验测定SPA及荚膜抗原。•核酸检测针对耐热核酸酶nuc、16SrRNA可鉴定葡萄球菌,测定macA可以快速检出MRSA。分离培养与鉴定•分离培养•脓液、分泌物等临床标本可接种血琼脂平板;•有污染的标本如粪便等应接种在选择平板上,如甘露醇高盐平板、哥伦比亚多粘菌素奈啶酸平板;•血液标本则用肉汤增菌培养基增菌后。初步鉴定•1)菌落性状平板培养基上孵育24h后,菌落外观疑为葡萄球菌者应进行革兰染色证实。•2)鉴别试验•触酶试验阳性、溶葡萄球菌素(200μg/ml)和呋喃唑酮100μg敏感,氧化酶试验阴性可以与其他革兰阳性球菌区别。•红霉素(0.4μg/ml)耐药和甘油需氧产酸可以与微球菌区别。(3)种的鉴定•1)凝固酶试验玻片法测定结合型凝固酶;试管法测定分泌型凝固酶。金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌呈现阳性反应。路邓葡萄球菌产生结合型凝固酶而不分泌游离型凝固酶,因而玻片凝固酶试验阳性、试管凝固酶试验阴性。•2)耐热核酸酶试验大多数金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、猪葡萄球菌能产生耐热核酸酶。此外表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、肉葡萄球菌含微弱耐热核酸酶。3)其他鉴定试验•磷酸酶试验、吡咯烷酮芳基酰胺酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、脲酶试验、β-半乳糖苷酶、3-羟基丁酮酸试验、新生霉素敏感试验、多粘菌素B耐药试验、糖产酸试验是常用的葡萄球菌属种间细菌的鉴定生化试验。(3)肠毒素检测•1)生物学试验采用幼猫腹腔注射(肉汤培养物或呕吐物),4h内发生呕吐腹泻和体温升高或死亡等现象者,提示金黄色葡萄球菌肠毒素存在。•2)琼脂扩散试验或ELISA法测定用琼脂扩散试验、ELISA法或放射免疫分析法检测样本中的肠毒素。•3)肠毒素基因测定针对肠毒素基因设计毒素的通用引物及特异性引物,应用PCR技术可直接进行分型测定。第二节链球菌属•链球菌属(Streptococcus)细菌种类多,分布广,是人和某些动物的寄生菌。其中某些菌种为毒力强的致病菌,另一些则是作为正常菌群栖居于宿主的呼吸道、消化道、泌尿生殖道,还有一些是皮肤上的过路菌和黏膜上的定居菌一、分类•(一)A、C、G群β溶血性链球菌–菌落直径大于0.5mm•A群的化脓性链球菌(S.pyogenes)、C群、G群的马链球菌(S.equi)和似马链球菌(S.equismilis);–菌落直径小于0.5mm•具A、C、G群抗原,统称米勒链球菌(S.milleri),主要分为3种:咽喉炎链球菌、中间型链球菌和星座链球菌。除此之外,米勒链球菌还有α溶血和不溶血的细菌。•(二)B群β溶血性链球菌又称无乳链球菌(S.agalactiae)。•(三)α溶血性链球菌–包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)和草绿色链球菌群(Viridansstreptococci)。•(四)不溶血D群链球菌–牛链球菌(S.bovis)二、临床意义•(一)致病因素•1.菌体细胞壁成分•(1)脂磷壁酸位于细胞壁中并伸展至菌体表面,与黏附宿主细胞有关。•(2)M蛋白是链球菌细胞壁中的表面蛋白质,具有抗吞噬和抵抗细胞内杀菌作用。M蛋白有抗原性,能刺激机体产生型特异性抗体;与心肌、肾小球基底膜有共同抗原成分。2.侵袭性酶•(1)链道酶(SD)也称链球菌DNA酶,能分解黏稠脓液中具有高度黏性的DNA,使脓汁稀薄易于扩散。主要由A、C、G群链球菌产生。•(2)透明质酸酶能分解细胞间质的透明质酸,使病菌易于在组织中扩散,又称扩散因子。•(3)链激酶(SK)又称链球菌溶纤维蛋白酶,能激活血液中溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶,使之溶解血块或阻止血浆凝固,有利于细菌在组织中扩散。重组链激酶目前用于治疗血栓性疾病。•(4)胶原酶能水解肌肉和皮下组织中的胶原蛋白纤维,便于细菌在组织中扩散。3.外毒素•(1)链球菌溶素•(2)致热外毒素(1)链球菌溶素•有溶解红细胞,破坏白细胞、血小板及毒害心脏作用•根据对O2稳定性:链球菌溶素O和链球菌溶素S①1.SLO绝大多数A群链球菌株和许多C、G群菌株能产生SLO,SLO为含-SH基的蛋白质,遇氧时-SH基被氧化为-S-S-基,失去溶血能力。若加入亚硫酸钠和半胱氨酸等还原剂,溶血作用可以逆转。SLO对中性粒细胞有破坏作用;对哺乳动物的血小板、心肌细胞、巨噬细胞、神经细胞等也有毒性作用。抗原性强,感染后患者机体产生抗SLO抗体,病愈后可持续数月甚至数年。风湿热患者血清SLO抗体显著增高,活动性病例升高更显著,可作为新近链球菌感染或风湿活动的辅助诊断。•2.SLS是一种小分子的糖肽,无抗原性。对氧稳定,对热和酸敏感。多数A、C、G群及某些其他群链球菌产生。能破坏白细胞和血小板。血琼脂平板上菌落周围的β溶血环是由SLS所致。(2)致热外毒素•由A群链球菌溶原菌株产生的致热外毒素(SPE),曾称红疹毒素或猩红热毒素。•为蛋白质,对热稳定,具有抗原性,是人类猩红热的主要致病物质,具有损害细胞或组织,使患者产生红疹并具内毒素样致热作用。•分为A、B、C三型,A型和C型分别由噬菌体携带的speA和speC编码,B型由染色体基因speB编码。均为超抗原,刺激T细胞诱发淋巴细胞合成和释放TNF、IL-1β和IL-6,进一步导致发热、休克及组织损伤。(二)所致疾病•1.侵袭性疾病•皮肤和皮下组织急性化脓性炎症感染部位界限不明显,脓性分泌物稀薄,常引起蜂窝组织炎;沿淋巴管和血流扩散引起急性淋巴管炎、淋巴结炎及败血症。•其他感染如扁桃体炎、咽炎、中耳炎、乳突炎、肾盂肾炎、产褥热等。无乳链球菌引起新生儿菌血症和脑膜炎。肺炎链球菌是大叶性肺炎、支气管炎的病原菌,还可引起中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、脑膜炎和菌血症。•草绿色链球菌是人体口腔、消化道、女性生殖道的正常菌群;可引起心脏瓣膜异常患者的亚急性细菌性心内膜炎。2.毒素性疾病•(1)猩红热是由产生SPE的A群链球菌引起的全身中毒症状。常继发于严重的咽炎或皮肤软组织感染。少数还可见心肌炎、肾小球肾炎等病变。3.变态反应性疾病•(1)风湿热由A群链球菌的多种型别引起,常继发于A群链球菌感染的咽炎,潜伏期为1~5周,易感人群为10岁以下儿童。临床表现以风湿性关节炎、风湿性心脏病为主。致病机制①链球菌细胞壁多糖抗原与心肌瓣膜、关节组织糖蛋白有共同抗原性;胞壁蛋白抗原与心肌有共同抗原性;属第Ⅱ型变态反应。②可能是M蛋白的免疫复合物沉积于心瓣膜和关节滑液膜上造成。属第III型变态反应。3.变态反应性疾病•(2)急性肾小球肾炎大多数由A群12型链球菌引起,多见于儿童和少年。临床表现为蛋白尿、浮肿和高血压。其致病机制:①链球菌的某些抗原与肾小球基底膜有共同抗原,机体针对链球菌所产生的抗体与肾小球基底膜发生反应,属第II型变态反应;②由链球菌的M蛋白所产生的相应抗体形成的免疫复合物沉积于肾小球基底膜,造成基底膜损伤,属于第III型变态反应。猪链球菌病•猪链球菌病主要是由几种C、D、E及L群链球菌引起,现已发现其荚膜抗原血清型有35种以上。大多数致病性血清型在1~9血清型。血清型2为最常见和毒力最强的血清型。人主要通过接触病死猪感染。三、微生物学检验•链球菌的基本特性•1.形态结构–链球菌是直径小于2μm的球形或卵圆形革兰阳性球菌,呈链状排列,链的长短和细菌的种类及生长环境有关。–肺炎链球菌呈矛尖状,宽端相对尖端向外,成双排列,无芽胞、无动力,但能形成荚膜和黏液层。2.抗原结构•抗原结构复杂,主要有多糖抗原和蛋白抗原,前者位于细胞壁以此可将链球菌分类为A、B、C、D、F、G等20群,后者主要有M蛋白、F蛋白和G蛋白等。3.变异性•肺炎淋球菌的pbp1a、pbp2x和pbp2b的单个突变或多个同时突变,导致对青霉素或头孢菌素的耐药。4.培养特性•兼性厌氧菌,肺炎链球菌和草绿色链球菌某些种需要CO2促进其生长•营养要求高,须在培养