GB4789312013食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科

中华人民共和国国家标准GB4789.31—2013食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验2013-11-29发布2014-06-01实施GB4789.31—2013I前言本标准代替GB/T4789.31-2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法》。本标准与GB/T4789.31-2003相比,主要变化如下：——修改了操作步骤；——增加了附录B。GB4789.31—20131食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验1范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌、培养的设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃，50℃±1℃;b)厌氧培养装置：41.5℃±0.5℃;c)显微镜：10倍～100倍;d)水平仪：噬菌体试验的工作台面应调整至水平位置;e)已灭菌1mL一次性注射器（应为塑料材质），针头无编号，使用前测定每滴5L~10L（每mL有100~200滴）可用;f)微量移液器及吸头（10L和5L）;g)定量移液器及吸头（100L和50L）;h)无菌吸管：10mL、5mL、1mL;i)无菌毛细管;j)无菌培养皿：90mm;k)无菌棉签;l)带盖的灭菌小试管：8mm×50mm;m)载物玻片。3培养基和试剂3.1亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中的A.1。3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中的A.2。3.3志贺氏菌（BCT）增菌液：见附录A中的A.3。3.4营养肉汤（NB）：见附录A中的A.4。3.5营养琼脂（NA）：见附录A中的A.5。3.6营养半固体琼脂（NSA）：见附录A中的A.6。GB4789.31—201323.7三糖铁琼脂（TSI）：见附录A中的A.7。3.8葡萄糖铵琼脂：见附录A中的A.8。3.9肠杆菌科诊断用噬菌体，7种和3种。必要时可再购置大肠埃希氏菌分型噬菌体（6种）一套。安瓿开启后用无菌毛细管吸出移入灭菌小试管内，如果每次使用量很少，可分装于2~3支试管内，保存于5℃冰箱备用。3.10沙门氏菌因子血清，志贺氏菌分型因子血清，致泻大肠埃希氏菌分型因子血清。因子血清的种类视需要而定。4检验程序4.1沙门氏菌的检验程序沙门氏菌的检验程序见图1。GB4789.31—20133图1沙门氏菌的检验程序4.2志贺氏菌的检验程序志贺氏菌的检验程序见图2。ONPG甘露醇、山梨醇检样O-1裂解其他均不裂解非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验证实非沙门氏菌沙门氏菌血清学试验证实沙门氏菌血清学试验证实非沙门氏菌非沙门氏菌报告前增菌、增菌和分离挑取可疑菌落TSI(斜面、底面、产气、H2S)蛋白胨水（靛基质）尿素（pH7.2）,KCN,赖氨酸H2S+,靛基质－，尿素－，KCN－，赖氨酸＋噬菌体试验H2S+，靛基质+，尿素－，KCN－，赖氨酸+各种噬菌体均不裂解非如左述的各种裂解结果H2S－，靛基质－，尿素－，KCN－，赖氨酸+/－＋,＋,－－,－+GB4789.31—20134图2志贺氏菌的检验程序Sh裂解，并呈现各种裂解模式Sh不裂解血清学试验与裂解模式相符且被1RTDSh裂解血清学试验与裂模式不相符或不被1RTDSh裂解生化分群试验葡萄糖铵试验必要时加做乙酸钠、克氏柠檬酸盐、黏液酸、七叶苷、水杨苷试验七叶苷\水杨苷试验志贺氏菌属分群及分型结果葡萄糖铵+或任何其他阳性结果非志贺氏菌报告非志贺氏菌非志贺氏菌噬菌体试验非如左述的各种反应结果检样挑取可疑菌落TSI，葡萄糖半固体增菌和分离TSI底层产酸,斜面产碱，H2S－不产气，无动力GB4789.31—201354.3致泻大肠埃希氏菌的检验程序致泻大肠埃希氏菌的检验程序见图3。图3致泻大肠埃希氏菌的检验程序检样E和或Sh、E－4噬菌体不裂解其他噬菌体裂解不同来源分离的菌株其裂解模式具有同一性TSI，靛基质，pH7.2尿素，KCN,赖氨酸，动力TSI底层＋，H2S－,KCN－，尿素－非如左述各种反应结果血清学试验ETEC+增菌和分离E和或Sh、E－4噬菌体裂解各种噬菌体均不裂解氧化酶－，G－杆菌EPEC+产肠毒素大肠埃希氏菌非大肠埃希氏菌赖氨酸－，靛基质+，动力－(O124动力+/－)肠毒素+EIEC+非如左述各种反应结果非大肠埃希氏菌非致泻大肠埃希氏菌肠道侵袭性大肠埃希氏菌肠道致病性大肠埃希氏菌乳糖发酵或不发酵的菌落3~5个噬菌体试验STEC(O157)stx1,stx2,hly+产志贺毒素大肠埃希氏菌eae+报告GB4789.31—201365操作步骤5.1前增菌、增菌和分离5.1.1沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按GB4789.4进行。沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录B。在食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。食物中毒标本不应前增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。5.1.2志贺氏菌的增菌和分离按GB4789.5进行。没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT增菌液。食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。5.1.3致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按GB4789.6和GB4789.36进行。食物中毒标本同时做增菌和不增菌步骤。5.2噬菌体试验5.2.1培养基的准备营养琼脂平板（含琼脂1%~1.5%，为防止变形杆菌的蔓延生长，可按0.02%量加入十二烷基硫酸钠），营养琼脂加热溶化后，加入每个9cm平皿中约20mL~25mL，放在水平台面上待其凝固。翻转平板，在36℃1℃培养箱内半开皿倒置约1h，或50℃1℃培养箱内半开皿倒置约30min，以烘干培养基表面水分。5.2.2试验菌液的准备5.2.2.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产H2S或不产H2S的菌落，和乳糖阳性产H2S的菌落。检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌落。检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃1℃培养20h～24h后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H2S，不产气无动力的菌落。下述两种方法可供制备试验菌液时选用。5.2.2.2方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于36℃1℃培养14h~24h。挑取此肉汤培养物1满环（约5L），稀释于盛有1mL~2mL的营养肉汤管内，使成为1:200~1:400稀释菌液，含菌量约为1×106CFU/mL。5.2.2.3方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有1mL~2mL营养肉汤管内，含菌量约为1×106CFU/mL。5.2.3涂抹试验菌液5.2.3.1斑点涂抹法：将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分，每等分可供涂抹1株细菌培养物。每挑取试验菌液1满环，涂抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹菌斑7个，外圈5个，内圈2个。5.2.3.2棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥。5.2.4滴加噬菌体用定量为1mL的一次性注射器（针头无编号，1mL约有100~200滴，每滴相当于5L~10L），在每一个菌斑上滴加噬菌体。或用定量为10L或5L的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴，每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同一种噬菌体。滴加的噬菌体依次为O-I、C、Sh、E、CE、E-4和Ent。滴加噬菌体时应将琼脂平板放在水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头。待7种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌GB4789.31—20137体液干燥。翻转平板，放在36℃培养5h~6h，和14h~24h各观察一次结果。如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于5L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间。5.2.5试验结果的判定必要时（例如不能测定到完整的血清型），可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。噬菌体试验的结果见表1。表1噬菌体试验结果序号噬菌体裂解模式判定结果O-ICShECEE-4Ent1CL------沙门氏菌属2CL----CL-沙门氏菌属(靛基质-),大肠埃希氏菌(靛基质+)3-CL--(-)(-)-弗劳地氏柠檬酸杆菌群a4--CLvvv-志贺氏菌属b,大肠埃希氏菌5CL-CLvvv-大肠埃希氏菌6v--CLvv-大肠埃希氏菌7----CLv-弗劳地氏柠檬酸杆菌群a,大肠埃希氏菌8-----CL-大肠埃希氏菌9-(-)v---CL阴沟肠杆菌0-------噬菌体不裂解培养物,用生化试验鉴定注：CL表示融合性裂解；–表示不裂解；（－）表示少量菌株裂解；v表示裂解或不裂解。a含弗劳地氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、布雷克氏柠檬酸杆菌、沃克曼氏柠檬酸杆菌和吉伦氏柠檬酸杆菌。b按表3检索并做血清学分型试验。5.2.6供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下3种噬菌体：沙门氏菌O-I噬菌体；E多价噬菌体，内含E和Sh；C多价噬菌体，内含C、CE和Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为4等分或6等分，每等分可供涂抹一株细菌培养物，每株培养物涂抹3个菌斑，外圈2个，内圈1个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹5条菌带，置数分钟，待菌斑干燥。依次滴加上述3种噬菌体。斑点涂抹法，一般可把O-I噬菌体滴加在内圈的菌斑上。带状涂抹法，可将O-I噬菌体滴加在菌带的左边。待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在36℃培养5h~6h，和14h~24h各观察一次结果。按表2判定结果。表2噬菌体试验简化诊断法O-IE多价C多价判定结果CL--沙门氏菌属vCLv大肠埃希氏菌--CL弗劳地氏柠檬酸杆菌群a---噬菌体不裂解培养物注：CL表示融合性裂解；–表示不裂解；v表示裂解或不裂解。a除表1的注中所述外，并含阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。GB4789.31—201385.3噬菌体不裂解培养物的补充生化试验少数沙门氏菌培养物不被O-I噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，按GB4789.4做5项生化试验，血清学分型鉴定后判定结果。5.4血清学分型鉴定及其他补充试验5.4.1沙门氏菌分型鉴定按GB4789.4进行。如果判定为沙门氏菌时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。5.4.2致泻大肠埃希氏菌鉴定5.4.2.1按GB4789.6和GB4789.36进行。分离的菌株应该同时被同样的几个噬菌体裂解后，用大肠埃希氏菌分型噬菌体试验，这些菌株应该具有相同的裂解模式，同时测定1RTD噬菌体的裂解情况。5.4.2.2产肠毒素大肠埃希氏菌，应有肠毒素试验的证实。5.4.2.3侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：赖氨酸脱羧酶试验阴性、无动力、产气或不产气（O124血清型亦可以为有动力、不产气），靛基质试验阳性。可进一步做豚鼠角膜试验，结果应该为阳性，质粒电泳应证明具有120~140Mdal大质粒，PCR试验证明具有ipaC或ipaH基因。5.4.2.4产志贺毒素大肠埃希氏菌O157:H7，典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气，硫化氢阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。PCR试验证明具有产志贺毒素基因stx1，stx2和溶血毒素基因hly。1RTD的E-2噬菌体裂解试验，能被1RTD的E-2噬菌体裂解（裂解程度包括从CL到少数几个噬斑）。对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，按照5.4.2.3的程序进行鉴定。5.4.2