人源性单克隆抗体和基因工程抗体

1四、人源性单克隆抗体和基因工程抗体21.EB病毒转化技术：利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体。(一)、人源性单克隆抗体3技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。2.人－鼠杂交瘤单克隆抗体：43.人－人杂交瘤单克隆抗体：人－人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠－小鼠杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B淋巴细胞融合；但可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合；故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。54.构建转人Ig基因组小鼠▶将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。▶用人Ig基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因小鼠，以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但已有成功的报道。65.严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：SCID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受人体组织或器官移植，形成人－鼠嵌合体小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库。7(二)、基因工程抗体基因工程抗体是利用基因工程的手段获得人源性抗体，主要包括以下几个方面：人－鼠嵌合抗体、改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体文库技术、表位印迹选择技术等。8抗体的重轻链构成的可变区(V区)与识别抗原有关，具有特异性；而恒定区(C区)与效应功能有关。人－鼠嵌合抗体就是通过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而C区是人源的。如此改造的嵌合抗体保留了原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力，人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。1.人－鼠嵌合抗体：9人－鼠嵌合抗体的制备102.改型抗体：也称CDR移植。用鼠源的CDR(可变区中和抗原互补结合构成抗原结合部位的部分）取代人抗体中相应的CDR部位，使得抗体中除构成抗原结合部位的3个CDR是鼠源以外，其余均为人源。这种抗体在人体内免疫性大大降低。11改型抗体（CDR移植）12Fab抗体：抗体Y形的两个臂称为Fab，它由可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的特性。单链抗体(ScFv)：用短肽接头[常用(Gly4Ser)3]将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构建表达；但亲和力会出现一定的下降。3.抗体片段：134.噬菌体抗体文库技术体外建立一个相应于体内B细胞库的抗体库，从中筛选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基因中，然后感染E.coli，使抗体基因的表达产物和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬菌体抗体。通过固相化的抗原进行筛选，不能结合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下来再次感染细菌进行扩增，多次吸附－洗脱－扩增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这些抗体可以做到全部为人源的。14155.表位印模选择技术：用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体，将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人单克隆抗体。16单克隆化有限稀释扩大培养单克隆化由单一细胞长成17Fab抗体分子的制备18利用基因工程制备单链抗体(ScFv)