植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合

陈传红制作第七章植物原生质体培养及细胞融合陈传红制作本章内容提要：原生质体培养的发展与意义原生质体的分离原生质体的培养植物细胞的融合体细胞杂种鉴定方法陈传红制作什么是原生质体（Protoplast）？•1880,Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质•含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。•Protoplast陈传红制作细胞陈传红制作微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图细胞壁主要成分：纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%陈传红制作一、发展简史及其意义1、发展史1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；1960年：英国诺丁汉大学Cocking教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。陈传红制作1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。1986年：Spangenberg对单个原生质体培养获得成功。1993年：有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。主要是农作物和经济植物，如大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等；陈传红制作、原生质体培养的意义（1）为细胞融合奠定基础克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。陈传红制作（2）是遗传工程的理想受体能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。Isolatedprotoplastarecapableofingestingforeignmaterialintothecytoplasm.Thismaterialincludestheintroductionofnuclear,chloroplasts,mitochondria,DNA,plasmids,bacteriaandviruses.原生质体也具有全能性原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点。陈传红制作（3）理论研究细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。•因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。•必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。陈传红制作二、原生质体分离（一）分离方法机械法：利刃机械切割酶解法：果胶酶和纤维素酶处理陈传红制作、机械分离（Machanicalisolation）•Cutplasmolyzedtissueandsubsequentdeplasmolysisresultsinexpansionandreleaseoftheprotoplastsfromthecutendsofthecell.•Inpracticethistechniqueisdifficultandtheyieldofviableprotoplastsismeager.Oneadvantage,however,isthatthedeleteriouseffectsofthewall-degradingenzymesonthemetabolismoftheprotoplastsareeliminated.高度液泡化的细胞陈传红制作、酶解分离（Enzymaticisolation）双子叶外植体/培养细胞单子叶植物胚性细胞2.1材料应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。陈传红制作酶的种类和浓度纤维素酶（Cellulase）OnozukaR-10果胶酶（Pectolyase）Y-23半纤维素酶（Hemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维素酶，果胶酶(0.2％-0.5％);酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大酶液PH值：5.4-5.8因为PH高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多陈传红制作酶液渗透压•裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。•常用稳定剂是糖醇系统，如：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。•目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。陈传红制作材料预处理(暗处理，预培养和低温处理)•在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。•原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。陈传红制作其它酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力2.5酶解处理的条件光：一般黑暗下静止进行；温度：25℃，兼顾原生质体及酶活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。陈传红制作原生质体分离过程（一步法——以烟草叶片为例）•第一步：预处理即对烟草植株限制供水。•第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外•表皮切成4cm的小块。•第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2.PH5.6。•第四步：将小块烟叶放入混合酶液25℃处理8~10小时•第五步：过滤、离心、洗涤（0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2）。如此2~3次、得原生质体。陈传红制作原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶陈传红制作•原生质体叶片•原生质体愈伤组织陈传红制作陈传红制作（二）原生质体纯化•酶处后得到混合液包括：•原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。•原生质体纯化方法：离心沉淀法漂浮法接口法陈传红制作、离心沉淀法•原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。•步骤：•第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。•第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。•第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。•第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。陈传红制作洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，10mmol/LCaCl2`H2O,0.7mmolKH2PO4,洗涤液pH：5.6陈传红制作陈传红制作、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。洗涤液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O。或11%~23%的蔗糖溶液。陈传红制作、接口法（以柑桔为例）25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液•原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。陈传红制作（三）原生质体活力测定1、FDA法2、TTC法3、酚藏花红染色法4、形态学观察法（以上见书128—129页）陈传红制作（四）影响原生质体数量和活力的因素•1、供试材料•2、酶的种类、组合和酶解时间•3、渗透压稳定剂•4、质膜稳定剂•5、pH值陈传红制作三、原生质体培养一）培养方法平板培养、液体浅层培养、固液培养二）影响原生质体培养的因素三）原生质体再生陈传红制作、平板（固体包埋）培养原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中。（一）培养方法陈传红制作饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。陈传红制作共培养法将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质陈传红制作、液体浅层培养用培养基离心用培养基悬浮陈传红制作、固－液共培养培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。固体培养基陈传红制作（二）影响原生质体培养的因素•1、原生质体的活力•2、起始密度•3、渗透压稳定剂•4、培养基成分•5、培养条件•6、植物材料和基因型陈传红制作第一次分裂（三）原生质体再生（Regeneration）再生细胞壁荧光增白剂（卡氏白)圆变为椭圆形第二次分裂第N次分裂小细胞团肉眼可见的细胞团愈伤组织陈传红制作陈传红制作陈传红制作肉眼可见细胞团陈传红制作愈伤组织陈传红制作愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株陈传红制作陈传红制作第三节原生质体融合是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术，又称体细胞杂交。不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。技术体系的3个环节：原生质体融合；选择融合体；杂种植株的再生和鉴定。陈传红制作、原生质体融合意义克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服柑桔多胚陈传红制作、成就1972年Carlson建立第一株烟草体细胞杂种。1975年柑桔原生质体培养成功；现有：苹果、