外源基因表达系统

2020/5/111第七章外源基因表达系统2020/5/112基因工程所用的宿主菌,皆经过人工改造原因是野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统,会切割未经修饰的外源DNA.经过改造的宿主菌一般具备下列特点限制系统缺陷型:不切割外源DNA.重组缺陷型:避免外源DNA与宿主DNA的重组.转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率.2020/5/113第一节大肠杆菌表达系统一.大肠杆菌表达体系的优点：•外源基因可以高水平表达•培养方便、价廉、可大规模生产•生物学、遗传学背景清楚•安全性好•寄主菌株及载体较多2020/5/114大肠杆菌2020/5/115二.大肠杆菌的表达条件•克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。•大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须置于原核启动子的控制之下。常用的启动子有Lac、trp、tac、T7、λPL等。•强启动子外源蛋白质的表达占菌体总蛋白质的10-30％。2020/5/116启动子有关知识•大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的重要元件，基因表达程度与启动子的强弱密切相关。•启动子的强弱主要取决于启动子本身的序列，尤其是－10区(TATAA)和－35区(TTGACA)的组成。在真核基因中发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于—25～—30bp处的TATAAAAG，也称TATA框(TATAbox)。2020/5/117常用的大肠杆菌启动子•Plac来源于乳糖操纵子•Ptrp来源于色氨酸操纵子•PL来源于λ噬菌体早期操纵子•PrecA来源于recA基因2020/5/118启动子的可控性目前使用的大肠杆菌启动子，一般含有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖的培养基内，Plac启动子处于阻遏状态，外源基因极少表达。2020/5/119•当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷isopropylthiogalactoside，IPTG),它们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上脱落下来，启动子打开并启动外源基因转录。（化学诱导）2020/5/1110温度诱导PL启动子将工程菌先置于300Ｃ进行培养，在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI857阻遏蛋白与PL的操纵子区域结合，关闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适的生长阶段，（一般为对数生长中期）时，迅速将培养温度提高到420Ｃ，此时CI857失活，从操纵子上脱落下来，PL启动子遂启动外源基因转录。2020/5/1111化学诱导与温度诱导在实验室规模比较容易做到，（发酵罐1～5升）。但在工业化生产时（发酵罐数十升～数百升乃至数千升），生产成本很高。2020/5/1112为解决此问题，可对工程菌进行改造。例如：采用双质粒表达系统将CI857阻遏蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下，克隆在一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白表达较低；第二个重组质粒则含有PL启动子控制的目的基因。当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp打开，CI857阻遏蛋白生成，由PL介导的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子关闭，CI阻遏蛋白不再生成，PL开放。2020/5/1113此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。2020/5/1114原核表达存在的问题翻译后的加工修饰真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还需要加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌细胞无此功能。细菌蛋白酶的存在细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割2020/5/1115真核基因在大肠杆菌细胞中表达的部位1.表达产物存在的部位①细胞质；②细胞周质；③分泌到细胞外①细胞质中表达：包涵体（inclusionbody):细胞质中不溶性的蛋白质聚集形成的颗粒。2020/5/1116•优点：形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋白酶的水解；对寄主无毒害•蛋白质产量高•表达载体构建比较简单2020/5/1117缺点：•形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性蛋白质的终产量低。•细胞质还原的环境不利于形成二硫键•N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响•蛋白质种类多，纯化工作量比较大。2020/5/1118②周质中表达•周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构•表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过细胞内膜到达周质2020/5/1119优点：•蛋白种类少，易纯化•酶解程度低•促进二硫键的形成和蛋白质的折叠•蛋白质N-端真实性缺点：•转运的效率不稳定2020/5/1120③表达产物分泌到细胞外•诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质•利用信号肽；•融合蛋白配体；•透化剂；蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。蛋白质合成后的靶向输送•蛋白质的靶向输送(proteintargeting)所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列。•信号序列(signalsequence)常见的信号序列由10～40个氨基酸残基组成，N端为带正电荷的氨基酸残基，中间为疏水的核心区，而C端由小分子氨基酸残基组成（加工区），可被信号肽酶识别并裂解。•信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP，即SRP受体）结合后→开放膜蛋白通道→分泌性蛋白穿过膜→膜外侧面信号肽酶切断信号肽加工区。信号肽的一级结构2020/5/1126优点：•酶解作用低•纯化方便•增进蛋白折叠•N-端的结构真实2020/5/1127分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。2020/5/1128短小芽孢杆菌表达蛋白质•例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需复性处理，即具有生物活性。产率达50mg/L。•例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率达1g/L以上。澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后可用手直接抓下羊毛。2020/5/1129利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇•纤维素是由葡萄糖单体以β－1，4－糖苷键连接的多糖，利用梭菌属嗜热菌株可由纤维素直接发酵生产乙醇。利用基因工程技术改造菌株，增加乙醇的产率，降低副产物（如乙酸、丁酸等）。2020/5/1130第二节酵母菌表达体系2020/5/1131酵母菌的种类•酵母菌（Yeast）有56个属500多个种组成。如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统，则酵母菌是最成熟的真核表达系统。常用的有：酵母属（如酿酒酵母）毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属）裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）2020/5/1132一.啤酒酵母•啤酒酵母又名面包酵母，被称为真核生物中的“大肠杆菌”。•易于培养•其单倍体核酸DNA容量为大肠杆菌基因组的3.5倍2020/5/1133啤酒酵母特点•培养简单,经济,快捷•适于有氧和无氧条件下的大规模培养•单倍体酵母细胞含有15Mb的基因组,16条大小约200-2200Kb的线性染色体。（培养室内空气可闻）2020/5/1134二.甲醇酵母表达体系2020/5/11351.甲醇酵母的生物学特点•甲醇酵母是一种甲基营养型酵母.在缺乏碳源如葡萄糖\甘油时,能利用甲醇作为唯一的碳源;生长温度28-30C。如巴斯德毕赤酵母就是常用的表达系统。2020/5/11362.甲醇酵母表达系统的优点•具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启动子，可严格调控外源蛋白的表达•作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而表达出有生物活性的外源蛋白•营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产•可高密度发酵培养.2020/5/1137•表达量高，数百mg/L以上水平•表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，十分有利于纯化。•糖基化程度低。2020/5/1138多型汉逊酵母表达系统•已用于表达乙肝表面抗原2020/5/11393.应用举例毕赤酵母牛溶菌酶；乙肝表面抗原；人肿瘤坏死因子；人表皮生长因子；人组织纤溶酶原活化剂；链激酶；破伤风毒素片段C；2020/5/1140乳酸克鲁维酵母牛凝乳酶；人白细胞介素1β；α－半乳糖苷酶多型汉逊酵母乙肝表面抗原α－半乳糖苷酶葡萄糖淀粉酶2020/5/1141第三节昆虫细胞表达系统昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲，其发育过程以变态而著称。昆虫是地球上分布最广、数量最多的动物，有上百万种。用于表达外源基因的多为家蚕系统。2020/5/1142昆虫表达系统昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加工和修饰.昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产.其生长速度快,不需要CO2培养箱,易于悬浮培养,可用于大规模表达蛋白质.2020/5/1143家蚕表达系统•家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已有5000余年历史。我国是家蚕业的发祥地，自古以来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。我国的生丝产量占世界总产量的70％，丝绸业的年产值达700亿元。2020/5/1144我国科学家于2003年率先完成家蚕基因组框架图，覆盖率和精确度分别达到95.54和99.95，是我国科学家向人类社会贡献的第三大基因组研究成果。2020/5/1145•家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素分子。2020/5/1146杆状病毒载体•杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒，宿主为无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。杆状病毒表达载体可分为两大类：1.表达单个外源基因2.表达多个外源基因2020/5/1147杆状病毒载体的构建以pUC质粒为基础构建，提供Amp抗性；多角体蛋白编码基因的启动子；多克隆位点位于该启动子的下游；家蚕丝心蛋白编码基因启动子：被认为是自然界最强的启动子，但由其介导的外源基因高效表达对宿主细胞的生理过程有干扰。2020/5/1148二.昆虫细胞宿主•常用的宿主为sf9和sf21。来源于草地夜蛾的卵巢细胞。2020/5/1149第四节哺乳类细胞表达系统优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，包括二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成、蛋白酶的定点切割产生具有天然活性的蛋白质缺点：细胞生长缓慢，培养周期长；生产成本高；2．蛋白质切割•末端切割膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信号肽。信号肽必须切除多肽链才具有功能。脊椎动物前胰岛素原长105aa，首先切除氨基端的24aa，成为前体胰岛素再将中间的一段切除，留下两端有活性的部分，即21aa酸残基的A链和30aa的B链两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰岛素。3、蛋白质的化学修饰简单的化学修饰：将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基团加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧基端不同蛋白质可以有完全相同的修饰相同的蛋白质可以有完全不同的修饰磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用复杂的修饰糖基化（glycosylation），将不同的碳水化合物（糖类）加到多肽链上。人类的ABO血型控制ABO血型的是一个复等位基因座位，编码负责将糖基加到红细胞膜上的糖蛋白分子上的酶。三个等位基因，编码三个不同的酶将N－乙酰－半乳糖胺（N－acety－galactosamine）加到糖蛋白上，A血型将半乳糖（galactose）加到糖蛋白上，B血型第三个基因编码的酶无功能，不能将任何糖加到糖蛋白上，O血型2020/5/1154常用的哺乳动物表达细胞•CHO细胞中国仓鼠卵巢上皮细胞，是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株。表达量可达10mg/L，可大规模