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一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1:25%蔗糖50mmol/LTris-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNase2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/LNaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70%乙醇8)TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2）10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4）0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。11)二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13)0.05mol/LNaOH。14)DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。（二）实验步骤：1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2)将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4)将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5)再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9)加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。二、PCR扩增目的基因(一)器材1)微量移液器2)灭菌的Tip头、PCR管3)PCR扩增仪4)目的DNA（DNA模板）5)dNTP混合物6)引物对7)Tap酶8)PCR扩增试剂盒（二）试剂1）10×PCR缓冲液（含Tris-HCl100mmol/L;MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶）2)脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成10mM——dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。）3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。4)酚：氯仿：异戊醇=25：24：15)3MNaAc、ddH2O6)无水乙醇：70%乙醇7)TE缓冲液（三）实验步骤1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀）ddH2O:补至终体积（25μl）10×PCR缓冲液1/10总体积2.0mMdNTPs1μl2U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl引物混合液（10pmol/μl/引物）1μlDNA模板0.6μl混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。2）在设定好的PCR仪上反应95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反应30轮。3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°C。取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4）—6）。4）转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。5）吸取上层液，转至另一已加5μl3MNaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C过夜。6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μlTE。（四）技术要点1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。(1)引物浓度：10pmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。(2)引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1OD约含33μg。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10pmol/μl。引物浓度计算公式：1pmol=(3.3×10-4μg)×n，n是引物的碱基数(3)Mg2+：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。(4)模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。(5)TaqDNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。2）扩增轮数与退火温度扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。退火温度计算公式：Tm值=（GC×4+AT×2）–4三、琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及材料目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂盒1)TAE电泳缓冲液浓储存液50×：242gTris；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)定容至一升。使用液1×：4.84gTris；1.15ml冰乙酸；2ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)定容至一升。2）样本液10×缓冲液:60%蔗糖；0.4%溴酚蓝（三）实验步骤1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。4）DNA样品按照10：1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。（四）技术要点1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）分离DNA的有效范围（kb）0.360～50.620～10.810～0.81.07～0.51.26～0.41.53～0.22.02～0.12）电泳中注意防止凝胶发热。3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。四、目的DNA的回收纯化(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统2）凝胶成像仪3）离心机4）单面刀片5）恒温水浴锅(二）试剂1）DNA回收试剂盒2）50×TAE3）ddH2O(三)实验步骤1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。2）按每100mg琼脂糖加入300—600μl溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6）12000rpm室温空离心1分钟。7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组(一)仪器及材料1）回收得到的目的DNA2）BamHI、HindIII、T4D