反相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)基本原理一、高效液相色谱法与气相色谱法比较①分析对象：气相色谱法只能分析气体和沸点较低的化合物；沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的有机物，主要采用高效液相色谱法进行分离和分析②流动相作用：气相色谱法的流动相是惰性气体，仅起运载作用高效液相色谱法中流动相不仅起运载作用，还与固定相一起共同完成对组分的分离③运行环境：气相色谱法一般都在较高温度下进行分离和测定，使其应用范围受到了较大的限制。高效液相色谱一般在室温下进行分离和分析，适于分离分析生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物和各种高分子化合物如：蛋白质、氨基酸、核酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料、药物等。④HPLC除用于分离和分析外，还可用于制备注意：由于气相色谱更快、更灵敏、更方便而且耗费低，因此凡是能用气相色谱法分析的样品一般不用液相色谱法。二、高效液相色谱法的类型高效液相色谱法可以分为：液液分配色谱法（LLPC）液固吸附色谱法(LSAC)离子交换色谱法（IEC）离子对色谱法（IPC）离子色谱法（IC）空间排阻色谱法（SEC）亲和色谱法（AC）三、正相色谱法NormalphaseHPLC正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正相色谱法适于分析极性化合物。氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖类物质。总之，正相键合相色谱法适于分析中等极性的化合物如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂和有机氯农药等。四、反相色谱法ReversedphaseHPLC反相色谱法的流动相极性大于固定相，极性大的组分先流出色谱柱，极性小者后流出，适于分析非极性化合物。现用得最多的是反相键合相色谱法。典型的反相键合相色谱是在ODS柱上，采用甲醇－水或乙腈－水作流动相，分离非极性或中等极性的化合物如同系物、绸环芳烃、药物、激素、天然产物及农药残留等。5.正相色谱与反相色谱法比较(1)NormalphaseHPLCnonpolarsolvent/polarcolumn(2)ReversedphaseHPLCpolarsolvent/nonpolarcolumn(3)Normal-(polarcolumn)versusReversedPhase(nonpolar)elution:(4)Reversed-phaseHPLCmostcommon(highpolaritysolvent,highpolaritysoluteselutefirst)RisC8orC18hydrocarbon(4)StationaryPhaseChoiceChoosecolumnwithsimilarpolaritytoanalyteformaximuminteractionReversed-phasecolumn(nonpolar)RhydrocarbonNormal-phasecolumn(polar)Rcyano(C2H4CN)氰基柱mostpolardiol(C3H6OCH2CHOHCH2OH)amino(C3H6NH2)氨基柱leastpolar(5)MobilePhaseChoicePolar(strong)solventinteractsmostwithpolaranalyte(solute)–elutesfasterbutlessresolutionStrengthcharacterizedbypolarityindexP'rangesfrom-2(nonpolar)to10.2(highlypolar)inamixtureP'AB=φAP'A+φBP'BfractioninmixtureInHPLC,capacityfactork'canbemanipulatedbychangingsolventcompositionbestresolution/timewhenk'=2-5HPLC日常维护（二）——色谱柱的使用和维护每天用足够的时间来平衡色谱柱，会在处理问题方面获得最大的“补偿”，而且色谱柱的寿命也会变得更长！一定得做！新的色谱柱在使用之前进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上的测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。一、平衡色谱柱1.反相色谱柱经过出厂测试后保存在乙腈/水中。在用流动相分析样品之前，应使用10~20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”。2.硅胶柱或极性色谱柱经过出厂测试后保存在正庚烷中。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。二、如何平衡色谱柱？新色谱柱，应首先用0.2ml/min的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态。这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡)三、色谱柱的再生色谱柱在使用一段时间后柱效会下降，这时可以考虑对色谱柱进行再生。进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议：最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。建议用来冲洗的溶剂体积色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积125*4mm1.6ml30ml250*4mm3.2ml60ml250*10mm20ml400ml再生方法：1.极性固定相的再生：正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水2.非极性固定相的再生：水乙腈氯仿(或异丙醇)乙腈水3.0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱四、注意：1.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。2.如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M的硫酸冲洗非常有效。五、色谱柱的维护1.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围3.避免流动相组成及极性的剧烈变化4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存在乙腈中6.压力升高是需要更换预柱的信号