甘蓝型油菜盐胁迫下幼苗鲜重和干重QTL定位及候选基因分析

作物学报ACTAAGRONOMICASINICA2017，43（2）：179-189http：//zwxb.chinacrops.org/ISSN0496-3490；CODENTSHPA9E-mail：[e-mail]本研究由国家自然科学基金项目（31371655）资助。ThestudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（31371655）.*通讯作者（Correspondingauthor）：刘列钊，E-mail：[e-mail]，Tel：[phone]**同等贡献（Contributedequallytothiswork）第一作者联系方式：E-mail：[e-mail]（收稿日期）：2016-04-20；Accepted（接受日期）：2016-09-18；Publishedonline（网络出版日期）：2016-09-27.URL：http：//：10.3724/SP.J.1006.2017.00179甘蓝型油菜盐胁迫下幼苗鲜重和干重QTL定位及候选基因分析侯林涛**王腾岳**荐红举王嘉李加纳刘列钊*西南大学农学与生物科技学院，重庆400715摘要：盐胁迫是非生物胁迫中影响作物产量的一个主要因素，利用分子标记方法选育油菜耐盐品种对提高油菜产量具有重要意义。选用来自GH06与P174杂交后通过单粒传法连续自交获得的高世代重组自交系群体，以含16gL-1NaCl的Hoagland溶液培养幼苗进行盐胁迫处理25d后，分别测定叶和根的鲜重及干重，根据已构建的高密度SNP遗传连锁图谱进行QTL定位，在QTL物理区间筛选耐盐相关基因并以极端表型材料进行qRT-PCR分析。采用复合区间作图法（CIM），在对照和盐胁迫处理中共检测到19个QTL，其中与盐胁迫相关的有6个，可解释的表型变异7.16%～16.15%，分布在A02、A04和C03染色体上，将QTL置信区间序列和拟南芥中与盐胁迫相关的基因比对分析，共找到8个候选基因。对其中4个候选基因在极端表型材料中的表达分析表明，BnaA02g14680D与BnaA02g14490D基因在盐胁迫处理后的48h或72h表达量均高于对照组，即基因的表达由盐胁迫引起，而BnaC03g64030D在敏感型材料中的相对表达量高于在耐盐型材料中，BnaC03g62830D在敏感型材料中没有明显变化，但在耐盐型材料中呈现先升高后降低的表达特征，其表达可能会增强植株对盐胁迫的耐受力。本研究为油菜耐盐基因功能挖掘和油菜耐盐品种选育奠定基础。关键词：甘蓝型油菜；盐胁迫；数量性状位点；单核苷酸多态性；候选基因QTLMappingforSeedlingDryWeightandFreshWeightunderSaltStressandCandidateGenesAnalysisinBrassicanapusL.HOULin-Tao**，WANGTeng-Yue**，JIANHong-Ju，WANGJia，LIJia-Na，andLIULie-Zhao*CollegeofAgronomyandBiotechnology，SouthwestUniversity，Chongqing400715，ChinaAbstract：Saltstressisoneofthemainabioticstressesaffectingcropyieldanditwouldbeveryimportantbyusingthesalttole-rancerelatedmarkersinrapeseedbreedingtoimprovetheoilseedproduction.Inthisresearch，theBrassicanapusL.highgenera-tionrecombinantinbredlines（RIL）populationderivedfromthecrossofGH06andP174viasingleseeddescentpropagationwasusedforQTLmappingandcandidategeneanalysis.Thefreshanddryweightofleafandrootweremeasuredat25daysaftertheseedlingsweregrowninHoaglandsolutionwith16gL-1NaCl.Compositeintervalmapping（CIM）wasusedtoidentifythere-latedQTLsaccordingtothehighdensitySNPgeneticmap，andthecandidategeneexpressionintheextremelinestestedbyqRT-PCR.Atotalof19QTLswereidentifiedinthecontrolandsaltstresstreatment，andsixQTLsweremappedonchromosomesA02，A04，andC03undersaltstress，withcontributionraterangedfrom7.16%to16.15%.EightgeneswereidentifiedaccordingtotheBLASTofgenesintheQTLconfidenceintervalsandthesaltstressrelatedgenesinArabidopsis.TheexpressionoffourcandidategenesintheextremelinesshowedthatBnaA02g14680DandBnaA02g14490Dundersaltstresstreatmentfor48or72hourshadhigherexpressionthanthecontrol，whichindicatesthattheexpressionsareinducedbysaltstress.Therelativeexpres-sionsofgeneBnaC03g64030Dinsensitiveextremelineswerehigherthanthoseintolerantextremelines.TherewerenochangedinexpressionforgeneBnaC03g62830Dinsensitiveextremelinesbutincreasedexpressionat48hoursandreducedexpressionat72hoursaftersalttreatmentintolerantextremelines，showingtheenhanceofplantsalttolerancepossibly.Ourresearchlaidafoundationforthefunctionresearchofsalttolerantgeneinrapeseedandthebreedingofsalttolerantrapeseed.180作物学报第43卷Keywords：BrassicanapusL；Saltstress；QTL；SNP；Candidategene土壤盐渍化是危害农业生产的主要因素之一，中国盐渍土面积大、分布广、类型多，总面积达9913万公顷，约占国土面积的1.03%[1]。土壤中过量的盐分会引起土壤物理和化学性质的改变，导致农作物生长环境的恶化[2]。在我国，油菜是继水稻、玉米、小麦、大豆之后的第五大作物，也是第一大油料作物，常年种植面积约670万公顷，总产超过1100万吨，年产菜籽油约450万吨，占自产植物油总量的40%以上，占草本植物油总量的57%以上[3]。甘蓝型油菜在三大栽培类型油菜中种植面积最大，被认为是比较耐盐的作物之一[4]。因此我们期望通过甘蓝型油菜耐盐性定位研究为其耐盐性和品种选育提供研究基础，进而实现盐碱地的农业高效利用，这对我国耕地农业生产能力的提升，耕地数量的增加，国家粮食安全的保障具有重要意义[5]。随着对油菜研究的不断深入及SNP芯片和重测序的普及，利用SNP分子标记技术建立高密度的遗传图谱，对油菜重要性状的QTL分析已经成为新常态，并且已经定位了与油菜含油量、千粒重、株高、产量等相关的QTL[6-10]，对于油菜在盐胁迫条件下的研究大多集中在生理反应的测定[11-13]，而疏于对油菜耐盐性状基因的定位。Li等[14]利用甘蓝型油菜DH系群体在正常和干旱胁迫条件下的5个指标（株高、根长、叶干重、根干重和总重）数据的QTL分析，分别检测到28个和31个QTL，其中在正常环境下，以油菜幼苗干重为指标检测到18个QTL，单个位点可解释的表型变异为6.43%～18.97%；旱胁迫环境下，检测到与幼苗干重相关的20个QTL，单个位点可解释的表型变异为5.87%～15.97%。荐红举等[15]利用本研究的RIL群体对盐胁迫下种子发芽率的QTL分析，检测到11个相应的QTL，位于A03和A09染色体上，可解释的表型变异为4.9%～10.9%。Moursi[16]利用DH群体在正常和盐胁迫环境下的干重和鲜重数据进行QTL分析，正常环境下找到4个QTL，分别位于A06、A05、C02和C03染色体上，贡献率为36%；盐胁迫环境下找到3个QTL，分别位于C03和C06染色体上，共同可解释的遗传变异25%。本试验利用已经构建的高密度SNP遗传连锁图谱对盐胁迫环境下RIL群体叶和根的鲜重和干重进行QTL定位，进而筛选出与盐胁迫相关的候选基因并分析其在极端表型材料中的表达量，为油菜耐盐基因的进一步研究提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料以母本GH06与父本P174杂交，采用单粒传法连续自交10代，构建高世代重组自交系群体（recombinantinbredline，RIL），之后随机选取其中的172个重组自交系进行SNP标记分析，构建高密度SNP遗传连锁图谱[17]。1.2盐胁迫处理挑选健康饱满、大小均一的油菜种子，置铺2层定性滤纸的9cm培养皿内，每皿20粒，加入适量的1/4Hoagland营养液培养7～8d。待种子发芽长成幼苗时，从每株系各取生长健康一致的1植株，3个重复，分别置装有质量浓度为0gL-1和16gL-1NaCl溶液[15]（以Hoagland营养液为母液配制）的塑料盆中，于温室培养25d，设定温度25℃，光照16h，黑暗8h。1.3幼苗鲜重、干重测定用滤纸吸干每株系3个植株水分后分别用电子天平测量幼苗的叶鲜重、根鲜重，取平均值。将幼苗放入105℃烘箱杀青30min，70℃烘箱烘干48h至恒重，然后用电子天平称量幼苗的叶干重、根干重，取平均值。1.4图谱构建及QTL分析所用SNP分子标记构建的遗传连锁图谱[17]，包含2795个SNP多态性标记位点，总长1832.9cM，相邻标记间平均距离为0.66cM。采用QTL分析软件WindowsQTLCartographer2.5[18]及复合区间作图（compositeintervalmapping，CIM）法对RIL群体幼苗的叶鲜重、根鲜重与叶干重、根干重进行QTL定位及效应检测[19]。CIM分析时，选取1cM的步长（walkingspeed），按照假定检测10和Zmapqtl模型3，选取参数1000次回归，显著水平为0.01。LOD≥3时，即认为该区间可能存在一个QTL。运行软件同时给出性状QTL的加性效应和解释的表型变异。按照McCouch等[20]的方法命名检测到的QTL，以“q”加相对应的性状再加染色体编号表示，字体为斜体。1.5候选基因的筛选将检测到的QTL的置信区间在甘蓝型油菜基因组[21]上查询到对应的序列，然后与拟南芥基因组序第