第九章：原生质体培养与体细胞杂交

第九章原生质体培养与体细胞杂交第一节原生质体培养一、原生质体概述4原生质体(protoplast)—脱去细胞壁、裸露的植物细胞。原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。（一）定义5原生质体无细胞壁障碍，便于进行有关遗传操作；在诱导条件下易发生融合，形成杂种细胞；具全能性,能再生细胞壁,能进行植物细胞的各项生理活动；稳定性较差，渗透压稳定剂。（二）原生质体特点二、原生质体的分离与纯化7叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料。1、叶肉细胞排列疏松，易于分离；2、含有叶绿体，为杂种细胞提供天然的选择标记；（一）原生质体材料的来源适宜于分离原生质体的细胞培养体系：结构疏松；处于对数生长期（二）材料的预处理作用：改变细胞和细胞壁的生理状态；增加细胞膜的强度；减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤。方法：暗处理；预培养；预质壁分离；89（三）原生质体的分离方法1、机械法：原生质体得率极低，难以大量制备2、酶法：大量获得植物原生质体的有效方法14A.纤维素酶，如OnozukaR-10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶，0.5-2.0％；B.半纤维素酶，如RhozymeHP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;C.果胶酶，如MacerozymeR-10又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用PectalyaseY-23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0.1-1.0％，悬浮细胞为0.05％；D.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；（1）酶的类型15酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以4.0-5.0及5.8为宜；混合使用时pH5.8-pH6.0为宜，降至4.8以下则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45μm微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。（2）酶液的pH值四、原生质体的纯化19采用40-300μm的网筛过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片，收集滤液，进行以下纯化方法。（1）沉降法：在适当溶剂内低速离心使原生质体下沉于离心管底部，细胞碎片留在上清液中，如此收集得到的原生质，反复3-4次。（2）漂浮法：原生质体比重较小，能在具有一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖溶液）中漂浮，然后用吸管收集。1、原生质体的纯化方法20（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以获得更为纯净的原生质体。1、原生质体的纯化方法21用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣吸去上清原生质体重悬于0.16mol/LCaCl2·2H2O溶液中在容器底部缓慢注入20%蔗糖溶液收集两层液面之间的纯净的原生质体600rpm,5-10min600rpm,5-10min原生质体的纯化步骤PurifiedprotoplastsLeaveswerecutinthinstripesanddigestedinanenzymesolutionPurificationofprotoplasts23原生质体的分离与纯化录相五、原生质体的活力测定25根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶片）及圆而鼓者为活原生质体。1、目测法26（1）FDA（荧光素双醋酸酯,）染色法(0.01%)原理:FDA本身无荧光，无极性，能自由穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解，分解形成荧光素，荧光素不能自由穿越细胞质膜。2、染色法27（2）酚藏花红染色法（0.01%）：无活力的原生质体能被染成红色，有活力的原生质体这中染料,因此呈现无色。（3）伊凡蓝染色法（0.025%）：已受损伤的的原生质体能摄取这种染料呈现蓝色，而完整的具活力的原生质体不被染色。六、原生质体的培养与植株再生29培养基成分无机盐：低大量元素浓度；高Ca2+浓度。有机成分：高的有机物浓度有利于细胞分裂，如KM8P（Kao等，1975)培养基。激素：不同种类要求差异较大；pH值：5.5-5.9培养基渗透压:培养基渗透压与细胞渗透压等渗或略高于细胞渗透压。培养环境：初期培养时应置于25-30℃、散射光或黑暗下培养1、培养条件302、培养方法31将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。液体浅层培养在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。液体-固体双层培养即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖与原生质体融化混合，将含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。固体平板培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。琼脂糖珠培养35初始植板密度一般为:1×104/ml~1×105/ml3、植板密度36细胞壁再生细胞分裂与生长愈伤组织或胚状体的形成再生植株4、原生质体再生植株的过程A-E,培养的欧当归(LevisticumofficinaleKoch))原生质体分裂再生成植株的过程F-L,培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J.2n=22，K.L.多倍体.A-D当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗E-H,红豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生质体培养再生植株第二节体细胞杂交40细胞融合（Cellfusion）:是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。植物体细胞杂交（Somatichybridization）：来自不同亲本的原生质体通过人工方法诱导融合、离体培养、再生成杂种植株的技术。一、定义41Tomato+Potato=Pomato1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）；42二、研究意义◆杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等。◆原生质体杂交：可以克服了远缘杂交的不亲和性，使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实。拟南芥杂交后代原生质体的选择选择适宜的原生质体是决定原生质体融合成败的重要因素。原生质体选择的考虑因素：量多、活力强、遗传一致；易于再生植株；具有可识别的异核体标记；亲缘关系不宜太远。4344三、融合方式原生质体融合可分为两大类：自发融合(spontaneousfusion)—由于去壁的裸细胞具有彼此融合的能力，在制备原生质体的酶解保温处理过程中，相邻的原生质体能彼此融合形成含有多个细胞核的融合体。45诱导融合（inducedfusion）——通过诱导剂使两个彼此相邻的原生质体相互融合的过程，称为诱发融合。三、融合方式46（一）化学诱导融合：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。NaNO3融合法高pH、高Ca2+法聚乙二醇（PEG）法诱导融合方法47机理：原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足以融合的程度。NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合.融合率0.1%-4%。1、NaNO3诱导融合482、PEG（聚乙二醇）与高pH、高Ca2+相结合诱导融合PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子桥，使原生质体发生粘连当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。49钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合,但对细胞有毒害；在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。融合率10-50%2、PEG（聚乙二醇）与高pH、高Ca2+相结合诱导融合50培养过程：愈伤组织不定芽根形成优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：融合过程繁琐PEG可能对细胞有毒害。PEG法诱导融合的特点51（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。诱导融合方法521、电融合法的原理在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。53与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：不存在对细胞的毒害问题；融合技术操作简便；融合效率高。2、电融合法的优点54细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；3、电融合的基本过程原生质体成串55膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。56Fusionphasesofoatprotoplasts(Avenasativa)57互补选择法:指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法叶绿体缺失互补选择法营养代谢互补选择法生长互补选择法矮牵牛+爬山虎融合体的选择四、融合细胞的筛选58抗性互补选择抗A不抗B型细胞抗B不抗A型细胞融合体含A、B培养基杂种细胞59白化互补选择法以矮牵牛为例：白化苗原生质体1白化苗原生质体2杂种细胞限定培养基绿色愈伤组织或幼苗杂种融合60营养缺陷型互补选择Gly-型细胞Pro-型细胞融合Gly-、Pro-培养基杂种细胞培养61原生质体矮牵牛爬山虎冠瘿混合体融合处理矮牵牛+爬山虎细胞团愈伤组织（异核体）NT培养基MS培养基(无激素)NT培养基NT培养基细胞团MS培养基(无激素)死亡MS培养基(有激素)愈伤组织原生质体细胞团MS培养基(无激素)死亡愈伤组织62双荧光标记选择法无叶绿体的原生质体含叶绿体的原生质体FITC标记苹果绿荧光红色荧光荧光显微镜杂种细胞将两种原生质体用不同的荧光染料进行标记，用电子荧光激活选择器进行自动分类。63物理选择法利用原生质体的大小、颜色、漂浮密度等差异进行选择。64形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。五、体细胞杂种植株的鉴定65杂种细胞的染色体数应该是双二倍体；利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。细胞学鉴定66SomatichybridshaveALLofthechromosomesfromeachparentplant67根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。同功酶鉴定6