搜索
浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis22(4):533~538,2010周国强1,2,严成其2,杨勇2,余初浪2,王栩鸣2,陈剑平2,*(1浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,农业部和浙江省植物病毒学重点实验室,浙江杭州310021):2009-11-12:国家高技术研究发展计划(2008AAO2Z125);浙江省自然科学基金(Z307451):周国强(1986-),男,河南信阳人,硕士研究生。主要研究方向为水稻抗病分子生物学。Te:l0571286404242*通信作者,陈剑平,Te:l0571286404258;E2mai:ljpchen2001@hzcnc.com:分子标记技术的快速发展和在植物病理学中的广泛应用,为水稻抗病基因的研究提供了新的途径和方法。文章概述了近些年被广泛应用的分子标记技术,比较分析了不同分子标记技术的特点,阐述了分子标记技术在水稻抗白叶枯病基因的定位、克隆及分子标记辅助育种中的应用,并就今后的发展作了展望。:分子标记;水稻;白叶枯病;抗病基因:S435111114+7:A:1004-1524(2010)04-0533-06Advanceofmolecularmarkeranditsapplicationinricebacterialblightresist2anceresearchZHOUGuo2qiang1,2,YANCheng2qi2,YANGYong2,YUChu2lang2,WANGXu2ming2,CHENJian2ping2,*(1CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China;2InstituteofVirologyandBiotechnology,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)Abstract:Bacterialblight(BB)isoneofthemostseriousdiseasesofrice(Oryzasativa),curbingtheproductofrice2plantingzone.Asthedevelopmentofmolecularmarkertechnology,itbecomesoneofthemostsignificantmeth2odstoinvestigatethediseaseatthemolecularleve.lInthispaper,weintroducedandcomparedthecommonmolecu2larmarkersdevelopedinrecentyears.Theapplicationandprospectsofthistechnologyongeneticmappingandclo2ningofriceBBresistancegenes,aswellasmolecularassistedbreeding,werealsoreviewedhere.Keywords:molecularmarker;rice;bacterialblight;resistancegene稻属(OryzaL.)隶属于禾本科稻族(OryzeaeDumort.),目前公认的约有19个野生种和2个栽培种,广泛分布于全球热带与亚热带地区,是禾本科中最重要的属之一[1]。水稻(Oryzasati2va)是世界上重要的粮食作物之一,由水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是危害水稻的重要病害,在水稻白叶枯病的流行年份可导致水稻减产20%~30%,严重减产时可达50%以上甚至绝收[2]。水稻抗白叶枯基因往往表现出寄主专一性,其生理小种的改变会使新育成的抗病品种丧失抗性[3]。因此,需要不断挖掘新的广谱抗源,通过分子标记辅助选择育种、基因工程育种等手段,将优异广谱高抗的抗病基因导入栽培稻进而提高宿主的抗病持久能力。随着分子标记技术的日益成熟以及各种新标记的诞生,该项技术大大方便了相关实验和研究的开展;同时,它打破了传统遗传学光依靠表型进行遗传分析的局限性,使得它在分子生物学研究方面的地位和意义也越来越重大。近20年来,分子生物学技术取得了长足的进展,被广泛应用于植物病理学中,为水稻抗病基因的研究提供了新的途径和方法。分子标记技术是分子生物学领域一项重要的研究技术,较之形态学标记、细胞学标记、生化标记,分子标记技术能最大限度地摆脱外界环境的干扰,准确地对样本进行分析;最大限度地降低了人为因素的影响,减少了误差;而且操作简便,结果的重复性好。随着分子生物学技术的发展,分子标记技术的种类越来越多,精确度越来越高,操作越来越简单。由于在原理及技术上的差异,不同的分子标记有着不同的特点。1分子标记的种类及其特点1.1DNA限制性内切酶片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)标记是发展最早的也是最简单的DNA标记技术,Bostein等[4]于1980年提出将其作为一种遗传标记。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异,这种差异是由基因组上限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起酶切产物的差异而造成的。RFLP标记遍布整个基因组,数量多,并且实验结果非常稳定,在遗传上呈共显性,多种农作物的RFLP标记图谱已经成功构建;但RFLP实验需要的DNA模板纯度高,量大,操作繁琐,检测周期长,成本高昂,探针具有种属的特异性,而且检测时需要放射性同位素做探针,存在操作安全性问题。近年来出现了一些改良的分子标记技术,比如单链构象多态性的限制性内切酶片段长度多态性(singlestrandconforma2tionpolymorphism,SSCP2RFLP)和变性梯度凝胶电泳的限制性内切酶片段长度多态性(denationgradientgelelectrophoresis,DGGE2RFLP)。RFLP作为第一代分子生物学标记,目前已广泛应用于分子生物学研究领域。1.2PCR1.2.1随机扩增多态性DNA随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术是以PCR(poly2merasechainreaction)为基础的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记技术,该项技术最早由Williams等[5]于1990年提出的,其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物,在热稳定的DNA聚合酶作用下,进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。RAPD技术所需要的DNA模板量少,在操作上能实现自动化,具有方便快捷的优点;同时,RAPD没有种属的界限,因而一套引物能多个物种共用;RAPD在实验操作过程中,不需要事先知道模板的序列信息,不存在放射性污染,实验得到的带谱信息明确。RAPD的不足之处在于:其不能区分纯合体和杂合体的差异,结果的重复性较差,反应受各种条件影响较大,溴化乙锭有一定的致癌作用。1.2.2简单序列重复区间简单序列重复区间(inter2simplesequencere2peats,ISSR)扩增多态性是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewciz等[6]于1994年提出的一项分子标记技术。它的生物学基础是基因组中存在的简单序列重复区间。ISSR标记根据植物广泛存在简单序列重复区间这种特点,利用在植物基因组中常出现的这种重复序列的本身设计出引物。用于ISSR2PCR扩增的引物通常为16~18个碱基序列,由1~4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中ISSR的5.或3.末端结合,导致位于反向排列,间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。ISSR比RAPD结果更可靠,且重复性好,同时操作简单而且安全,没有放射性污染,对模板纯度要求低。但ISSR标记扩增出来的条带往往难以分辨出等位基因的信息,而该实验的关键的PCR反应要求条件比较苛刻,Taq酶活性,Mg2+离子浓度,退火温度等都会影响扩增的结果,所以做好PCR扩增有一定的难度。1.2.3简单重复序列简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)分子标记是近年发展起来的第二代分子标记。SSR分子标记技术是基于真核生物基因组#534#浙江农业学报第22卷第4期(2010年7月)中均匀分布的一类短的串联重复序列,通常由(CA)n,(AT)n,(GC)n,(GCC)n组成的简单重复序列,其侧面往往具有比较保守的单拷贝序列。根据两侧的保守序列设计PCR引物,进行全基因组的PCR扩增,其产物通常用高浓度的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,根据条带的大小,便可以判断不同品种基因组间的SSR片段重复的差异。SSR标记是一种共显性DNA分子标记,能区分杂合子和纯合子,具有重复性好、可靠性高和多态性丰富等优点,同时操作简单,对模板的纯度要求也不高。但SSR标记有种属的特异性,不能跨物种使用;同时,设计SSR标记往往要知道保守序列的信息,合成SSR标记需要的成本代价较高。1.2.4序列标签位点序列标签位点(sequencetaggedsite,STS)分子标记是指基因组上任意一段独一无二的已知核苷酸序列的DNA片段,是基因组中任何单拷贝的短DNA序列,长度在100~500bp之间,任何DNA序列,只要知道它在基因组中的位置,都能被用作STS标签。STS标记技术是一种共显性标记,对模板的纯度要求不高,实验操作简单,能直接在电泳图上读出数据。STS标记可以为研究基因的多态性提供很多有价值的资料。1.3PCR1.3.1扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)是一种通过对限制性酶切片段选择性扩增来显示限制性片段的多态性的分子标记技术,该项技术既利用了限制性内切酶的方法又利用了PCR技术。AFLP技术最早是由Zabean于1993年提出的,它集RFLP和RAPD的优点于一身。AFLP技术是先将基因组DNA用限制性内切酶消化,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点,通过PCR扩增,产物用电泳检测多态性。AFLP技术具有RFLP的稳定可靠性和重复性好的特点,又具有RAPD的快速高效的特点,而且条带丰富,能提供的信息更多。但由于该项试验技术受到专利保护,故使用成本比较高[7]。1.3.2切割扩增多态性序列切割扩增多态性序列(cleaveamplifiedpolymorphicsequences,CAPS)标记是一种通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区域多态性的分子标记技术。其基本原理是先利用已知位点的DNA序列设计一套特异的引物,利用这些引物来扩增该位点的DNA片段,然后用限制性内切酶切割所得产物进行电泳并分析其条带。其优点是操作步骤简单、精确度和多态性高。但该项技术易受到实验条件影响,成本也比较高。1.41.4.1单核苷酸多态性单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymor2phism,SNP)分子标记技术是根据测序技术发展而来的,其分子生物学依据是:基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,包括单碱基的转换、颠换,以及单碱基的插入或缺失等。SNP属于第三代遗传标记,其具有在基因组中数量多,分布密度高等优点。随着测序技术的发展,该项分子标记技术可以实现大规模、高度自动化的分析,比以SSR标记为代表的第二代分子标记工作效率更高,更适合于大样本量检测分析,因此SNP标记被认为是很有应用前景的分子标记技术。1