16-分子标记辅助育种

第十六章分子标记辅助选择育种第一节分子标记的类型和作用原理第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术第三节作物MAS育种DNARNAProteinPhenotype育种工作的关键：如何提高选择效率传统育种一般是首先通过各种途径创造遗传变异，然后从分离群体的后代中进行优化选择和评价，这种选择是建立在植株的表现型基础之上的，这就要求育种家必须具有丰富的实践经验，而且费时、费力。作物的许多重要农艺性状为数量性状，或为多基因控制的质量性状为表型难以准确鉴定的性状。此时根据表现型来对性状进行评价是不确切的，因而选择是低效的。遗传标记：可以稳定遗传的，易于识别的特殊的遗传多态性形式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变（差）异；在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。形态标记(morphologicalmarkers)：指植物的外部形态特征，如矮秆、白化、黄化、变态叶、雄性不育等。不足（1）数量有限，而人工培育形态标记材料的周期长；（2）一些形态标记的多态性差，易受环境因素的影响；（3）一些形态标记对植株的表型影响太大，与不良性状连锁细胞学标记(cytologicalmarkers)细胞内染色体的变化，包括染色体数目或结构的变异可通过染色体核型（染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C、N、G带等）分析来测定基因所在的染色体及相对位置，或通过染色体代换等遗传操作来进行基因定位。CytogeneticMapping（1）采用染色体染色的方法区分染色体异染色质和常染色质、染色体长短、臂比、中心粒位置等等进行染色体分型。为了显示染色体的结构改变，从60年代起建立了一系列染色体显带技术，包括Q、G、C、R、T带分析等。其中应用最广的是G显带技术。为了进一步提高分辨率，后来又建立了高分辨G显带技术，可把染色体的细微变化精确地定位到某一特定染色体的某一区带上。CytogeneticMapping（2）细胞遗传学基因定位示意图，从图中可以看出，不同基因定位于染色体不同位置上。这种结果仅仅是粗略的定位，显示的是基因在染色体上的物理定位。CytogeneticMapping（3）采用荧光染色体原位杂交的方法进行细胞学遗传学定位图示：不同的探针采用不同的荧光标记，从而可以进行荧光定位分析。不足（1）细胞学标记材料的选育需要花费大量的人力和较长的时间；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感或适应变异的能力差而难以获得这类标记；（3）一些不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状则难以用细胞学方法检测；生化标记(biochemicalmarkers)利用基因的表达产物，主要包括贮藏蛋白、同工酶（具有同一底物专一性的不同分子形式的酶）和等位酶（由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同）等，可以直接反映基因表达产物的差异，受环境的影响较小。不足：标记数量远远不能满足实际的需要;存在组织和器官特异性。特点（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定。（2）数量多（理论上遍及整个基因组）（3）多态性高（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。（6）成本不太高目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用。显性标记(dominantmarkers)：指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD、AFLP、ISSR等。共显性标记(co-dominantmarkers)：指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。如RFLP、SSR、SCAR等。F1P1P2F1P1P2一、分子标记的类型和特点分子标记以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记）以PCR技术为核心的DNA标记技术（RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、AFLP标记、STS标记）以测序为基础的新型的分子标记（SNP标记、EST标记）第一节分子标记的类型和作用原理标记名称RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTSCAPs主要原理限制酶切Southern杂交随机PCR扩增限制性酶切结合PCR扩增PCR扩增随机PCR扩增特异PCR扩增特异PCR扩增PCR扩增产物限制性酶切多态性水平中等较高非常高高高中等检测基因组区域单/低拷贝区整个基因组整个基因组重复序列重复序列间隔的单拷贝区整个基因组单拷贝区整个基因组可靠性高中高高高高高高遗传特性共显性显性/共显性共显性/显性共显性显性/共显性共显性显性/共显性共显性DNA质量要求高，5-30μg中，10-100ng很高，50-100ng中，10-100ng中，2-50ng中，5-10ng高，50-100ng实验周期长短较长短短短短短开发成本高低高高低高高高二、分子标记的原理和遗传特性(一)RFLP（限制性片断长度多态性）标记特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。1、RFLP标记原理ABAB限制性内切酶位点与放射性探针结合部位①限制性内切酶酶切后；②电泳分离DNA片段；③转移至硝酸纤维素薄膜；④与放射性探针Southern杂交⑤放射性自显影或酶学检测分析阳性条带。可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。1、RFLP标记原理（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。2、RFLP标记的特点第二类是以聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR反应）为基础的各种DNA指纹技术。PCR技术的原理1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。二、分子标记的原理和遗传特性(二)RAPD（随机扩增多态性DNA）标记Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。primerABC1、RAPD标记原理（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性）不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。2、RAPD标记的特点二、分子标记的原理和遗传特性(三)AFLP（扩增片断长度多态性）标记AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由Marc和Pieter发明创造的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100~150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。1、AFLP标记原理对基因组DNA进行双酶切，在使用的两种限制性酶中，一种为酶切识别位点为4碱基的酶，另一种为识别位点为6碱基的酶。进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1~3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。2、AFLP标记的特点（1）结合了PFLP稳定性和PCR技术高效性的特点，不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。（2）多态性丰富（3）标记多数具有共显性表达，无复等位效应，表现孟德尔方式遗传。（4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的质量要求也较高。二、分子标记的原理和遗传特性(四)SSR（简单重复序列）标记又称微卫星DNA(Micro-satelliteDNA)标记；它是一类由1-6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置。如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十~几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了２万余个位点。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。1、SSR标记的原理微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果2、SSR标记的特点（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；数量几乎无限，（2）SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。DNA分子标记在植物生物技术中的应用DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：构建高密度的遗传连锁图：在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。进行基因定位：基因定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。遗传多样性和物种亲缘关系：分子图谱的构建和基因定位更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。表196份参试材料的编号及名称编号序号材料号编号序号材料号编号序号材料号编号序号材料号1R-1扬农啤6号25R-25BARI-17649S-1朸系14373S-25BARI-1472R-2扬农啤7号26R-26BARI-18050S-2连87-34-274S-26BARI-1613R-3苏农91-711227R-27BARI-19251S-3福84-810475S-27BARI-1624R-4广麦940228R-28BARI-19852S-42004-日引3号76S-28BARI-1665R-5扬农2号29R-29BARI-19953S-5甘啤2号77S-29BARI-1716R-6盐93-14630R-30BARI-21254S-6连901578S-30BARI-1737R-7浙934331R-31BARI-23055S-7驻9505-1-379S-31BARI-1748R-8浙708232R-32BARI-23456S-8苏引麦3号80S-32BARI-1759R-9浙95-5433R-33BARI-24057S-9单281S-33BARI-17810R-1093-16634R-34BARI-24558S-10苏引麦2号82S-34BARI-18911R-11矮杆-1