沙门氏菌

沙门氏菌检测致病菌的食品卫生学意义食品卫生标准规定任何食品中不得检出致病菌致病菌对人体健康的威胁是直接的和肯定的根据不同食品被污染的特点重点检验某些细菌如蛋禽肉主检沙门氏菌，罐头检肉毒梭菌等微生物毒素也是重点，如金葡的肠毒素、黄曲霉毒素等微生物与食物中毒概念：指摄入了含有生物性、化学性有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后出现得非传染性的急性、亚急性疾病。特点：潜伏期短，来势急剧，短时多人同时发病；临床表现大致相同；与吃某种有毒食品有关；发病率高，人与人之间并不传染。分类：微生物性（细菌性、真菌性），化学性，动、植物性，以细菌性最常见。细菌性食物中毒概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性肠胃炎为主的疾病。分类：感染型、毒素型、不定型病原菌常见食品潜伏期病程症状沙门氏菌肉乳蛋6~8h3~7d恶心呕吐腹痛发热冷汗头痛副溶血性弧菌水产品腌制品8~24h1~3d恶心呕吐腹痛腹泻蜡样芽孢杆菌米饭肉乳淀粉类30~60min1d恶心呕吐腹痛腹泻GB4789.4-2010沙门氏菌检测方法本标准参考采用了AOAC/FDA的方法。——规范了样品制备过程；——修改了原标准中前增菌和增菌部分。——增加了显色琼脂。对原标准中生化试验部分进行了修改。增加了生化鉴定试剂盒和全自动生化鉴定系统的条目。沙门氏菌食物中毒引起食物中毒最常见的沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌易引起沙门氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳类食品中毒原因：1、食用病畜禽的肉制品食品2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染3、用不洁净水外理食品沙门氏菌的从属与分类归于肠杆菌科沙门氏菌属下设6个亚属：I、II、IV、V、VI及III（原亚利桑那菌属）常见的种：鸡沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌…形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。培养特性：需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4。营养要求：不高，普通培养基生长良好。非如上述的各种反应检样前增菌选择性增菌BSXLD(或HE，显色培养基)挑取可疑菌落选择性平板筛选生物化学筛选非沙门氏菌H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙门氏菌血清学试验报告生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定系统前增菌法25g+BP225mlBPW1ml+TTB10ml42℃±1℃，18h~24h1ml+SC10ml36℃±1℃，18h~24hTSI，靛基质,尿素(pH7.2),KCN,赖氨酸，营养琼脂血清学鉴定BSXLDDHLHESS沙门氏菌写真照前增菌BPW（碱性蛋白胨水）：用于修复受损伤的沙门氏菌，但由于其不具有选择性，因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多干扰鉴定结果，故建议最好控制在4h为好。经前增菌后的样品与选择性培养基按1：10加入，例如1mL样品加入10mLSC中未经前增菌而直接进行选择性增菌的样品最好与增菌液按1：1稀释，而不可按1：10稀释，因为食品中沙门氏菌数量较少，1：10稀释将降低检出率。常用选择性培养基比较SCTTBMM亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37度适合其他沙门菌生长，42度，18~24hr为防漏检宜SC+TTB/MM主要杂菌为大肠埃希氏菌，而两者区别在于是否发酵乳糖，故加入乳糖、酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落加入硫化氢是因为第III属产硫化氢而缓慢发酵乳糖BS选择性最强，可延长时间以免沙门菌生长亦被抑制多采用BS搭配DHL/SS/HE/WS，互补防漏检指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄糖+H2S黑色有金属光泽、棕褐或灰色，周围培养基黑或棕色，或不产硫化氢而呈灰绿色DHL乳糖+H2S乳糖（+）：粉红色，（-）：无色半透明无色半透明，产硫化氢者中心黑色SS乳糖+H2SHE乳糖+H2S乳糖（+）：黄色，（-）：蓝色蓝绿色或蓝色，产硫化氢者中心黑色WS乳糖+H2S克氏三糖铁（TSI）反应原理原理：三糖利用培养基：干粉或生化管接种方法：穿刺划线结果：产酸／碱，产气，硫化氢注意：高层斜面葡萄糖（1g/L）蔗糖（10g/L）乳糖（10g/L）三糖铁（TSI）反应模式及意义葡萄糖乳糖蔗糖说明+++分解糖类产酸→pH↓→指示剂变黄→斜面底层均产酸变黄记为A/A模式+--斜面因葡糖含量少故分解完后利用蛋白胨产碱且大于酸量故由黄而深红，记为K，底层无氧故缓慢分解葡糖而产酸变黄记为A，K/A模式++-由于乳糖或蔗糖量大故斜面和底层均产酸变黄，亦为A/A模式+-+•若分解硫化氢则产生黑色FeS沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝•只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门菌的可能性•其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌生化实验原理-硫化氢实验目的：检测细菌对含硫化合物的分解能力原理：细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢与培养基中的铁或者铅离子生成黑色化合物。方法：接种三糖铁琼脂或悬挂醋酸铅试纸。结果：培养基出现黑色为阳性生化实验原理-动力试验原理：在半固体上穿刺接种后，细菌因具有鞭毛扩散生长结果：阳性——扩散生长阴性——沿穿刺线生长􀂙注意：培养基温度；剧烈运动可能出现假阳性结果生化实验原理-糖苷醇类发酵试验不同细菌含发酵各种糖类的酶不同，分解糖类（糖醇类）的能力亦不同，根据分解不同糖类后产物的差异，来鉴定细菌。结果：若细菌分解糖类产酸，使培养基中的指示剂显酸性反应，颜色发生变化，若产气可使培养基中的导管或者琼脂出现气泡，无变化则说明阴性。说明：指示剂：酚红（黄红）、溴甲酚紫（黄紫）、溴麝香草酚蓝（黄蓝）注部分糖类灭菌需防止高温破坏。生化实验原理-赖氨酸脱羧酶试验目的：通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌。原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2，使培养基PH升高，指示剂显色。常用氨基酸有三种：赖氨酸：经赖氨酸脱羧酶生成尸胺和CO2。鸟氨酸：经鸟氨酸脱羧酶生成腐胺和CO2。精氨酸：经精氨酸脱羧酶生成精胺和CO2。结果：检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照（无氨基酸）为黄色。生化实验原理-尿素酶试验目的：通过检测尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨，使培养基PH值升高，用酚红指示剂测出。结果：培养基变红为阳性，不变为阴性。生化实验原理-氧化酶实验原理：细胞色素C对苯二胺+α萘酚吲哚酚蓝􀂙试纸片法操作：1、白金环取菌苔到试纸上2、加１滴生理盐水到试纸􀂙结果：阳性——３0秒内变蓝,阴性——不变色注意：避免含铁物质；空气易氧化生化实验原理-靛基质实验(靛基质试验)目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚。方法：纯培养物接种蛋白胨水后35℃培养24-48h沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml观察。结果：两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。生化实验原理-氰化钾实验原理:氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.试验方法:取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，36±1℃培养24～48h，观察结果。结果记录:对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。生化实验原理-β-半乳糖苷酶试验(ONPG实验)目的：迅速及迟缓分解乳糖的细菌阳性，而不发酵乳糖的沙门氏菌为阴性。原理：细菌迅速分解乳糖是有β-半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶，ONPG分子与乳糖相似所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷结果：呈现黄色为阳性反应，通常20-30min内显色注意：为提高阳性反应速度，需大量接种培养物。过酸出现假阴性，过碱则出现假阳性。商品化的成套生化试剂盒API生化鉴定系统是法国梅里埃生物公司出品的微生物生化检测系列产品，原理是利用细菌对于各类化学物质（碳水化合物、氨基酸及蛋白质、无机盐类等）的代谢能力以及酶类的存在与否等生化特性来鉴定细菌的一种方法，当反应能够导致反应体系的PH值变化或产生显色物质，加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反映出来。API试验的本质就是利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，常用于细菌的鉴别。1.分离单个菌落2.调制菌液3.将菌液接种到小杯中4.试条放进孵育箱内，35–37度，18-24h5.附加试剂加进适当小孔内7.将反应结果输入数据库软件中得到生化谱代码8.软件自动查询报告最符合的菌名6.根据标准色卡判读反应结果梅里埃Vitek-2和其它国产成套试剂血清学实验原理什么是血清学反应？血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。什么是抗原？是指能刺激机体免疫系统产生免疫应答而生成抗体和致敏淋巴细胞等免疫应答产物，并能与之发生特异性结合的物质。产生的相应抗体与抗原结合，形成抗原—抗体复合物，产生免疫反应，从而保护机体不受抗原侵害而造成破坏。一般抗原都是外来物体，如细菌、病毒、寄生虫等。血清学实验原理什么是抗体？机体受外来抗原物质刺激后，产生的一种与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(Ig)被分为G，A，M,E,D等最典型的抗体是IgG,有Y型三维结构,包含两套重链和轻链。抗体攻击抗原（居中者）血清学实验原理何谓凝集反应？颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutinationreaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。何谓直接凝集反应？颗粒性抗原如细菌和细胞与相应抗体直接结合所出现的反应玻片凝集法原理何谓玻片凝集法？是一种常规的定性试验方法。用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有白叶枯病菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。玻片凝集法原理单价血清：含单一抗体的血清多价血清：含多种抗体的血清如A~F多价步骤：先多价后单价，先常见的后不常见的，先O后H，根据结果查表得到鉴定菌种抗原准备：多采用15g/L琼脂斜面培养物若O血清不凝集可转种至高含量（2.5~3%）琼脂培基上，干燥利于O-Ag发育沙门氏菌的抗原类型O抗原（菌体）：O1…O67共58种，一种菌可能含1种或多种O-Ag，含相同O-Ag的归为一个血清群。有A、B、…Z、O57~63，O65~67，多为A~F群，故先要用此多价血清初筛H抗原（鞭毛）：特异相（a~z，z1~z55），非特异性相（1，2…l，w），多为双相菌，可发生相位变异Vi抗原（表面）：可阻止O与抗体反应，加热可消除H抗原菌体抗原（O抗原）表面抗原（Vi抗原）玻片凝集法操作•先应在玻片上滴加1滴生理盐水，加入菌苔做阴性对照并观察是否自凝，若有则说明该菌株发生S-R变异失去了O抗原成为粗糙型，故不能进行血清学分型。菌体抗原（O抗原）的检测A-F多价血清凝集O4O3,10O7O8O9O2O11O19O34O15O10B群？C1/C4群？C3群？E3群？E2群？E1群？E4群？D群？A群？F群？A-F多价血清不凝集采用9种多价血清逐一排查O多价1O多价2O多价3O多价4O多价5O多价6O多价7O多价8O多价9A~F群包括6，14群13，16，17，18，21群28，30，35，38，39群40，41，42，43群44，45，47，48群50，51，52，53群55，56，57，58群59，60，61，6