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指导教师：教授老师老师六种沙门氏菌检测方法的研究班级：级动医一班学生：学号：报告内容研究背景研究内容方法结果讨论研究背景沙门氏菌属是一群寄生在人和动物肠道内的无芽孢直杆菌，能引起人和动物的多种沙门氏菌病，是人类食物中毒的主要病原之一，是食品安全与质量检测的一项重要指标。研究背景沙门氏菌的风暴已经席卷全球5六种沙门氏菌的检测方法TEXT一传统检测法二API20法三VITEK法四VIDAS法五普通PCR法六实时荧光法CompanyLogo传统检测法4.血清学鉴定2.染色特性1.培养特性FourThreeTwoOne3.生化鉴定沙门氏菌在各培养基上的典型特征A.BS琼脂平板B.SS琼脂平板C.显色培养基D.XLD琼脂平板染色特性A.标准菌株：ATCC14028生化鉴定沙门氏菌生化试验反应结果三糖铁琼脂斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶OPNGV-P吲哚KA+++―――注：K：产碱；A：产酸；+：阳性；―：阴性沙门氏菌在干制生化鉴定试剂盒的反应结果氨基酸赖氨酸靛基质尿素氰化钾对照氰化钾甘露醇山梨醇ONPG++――――++―血清学鉴定多价OO4O3O10O7O8O9O2O11O1O5O27+――――――――+++gfsibdachmw―――+―――――――H抗原鉴定O抗原鉴定最后得出结果为（1,4,5,12：i）判定为鼠伤寒沙门氏菌API20法API20E法根据沙门氏菌的21个生化反应，每3个试验为一组，每个阳性试验分别赋予数值1、2或4，阳性反应以相应的数值相加，根据鉴定手册鉴定为Salmonellaspp沙门氏菌API-20E试条中的生化反应结果VITEK法VITEK法：利用沙门氏菌常见的29种生化反应，对1麦氏浊度的沙门氏菌进行自动化检测，结果为99%Salmonellaspecies，＜1%EscherichiacoliVIDAS法沙门氏菌经过1)前增菌；2)增菌；3）后增菌三步，进行上机检测，检测值为1.09≥检测阈值0.23，判定为沙门氏菌为阳性。普通PCR法PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。10×Buffer(Mg2＋)5μLdNTP(2.5mM)6μL上游引物（invA-F）1μL下游引物（invA-R）1μL模板DNA5μL双蒸水31.7μL50μL95℃5min95℃10s60℃20s38个循环72℃60s72℃7min普通PCR法特异性检测普通PCR法灵敏性检测11ng1.1ng0.1ng11pg1.1pg0.1pg0.01pg实时荧光PCR法两步法RT-PCRSYBRGreenⅠ10µL上游引物（P1）0.4μL下游引物（P2）0.4μLDNA模板2μLdH2O7.2μL20μL95℃30s95℃5s60℃20s65℃15s95℃0.1℃/s40个循环实时荧光PCR法标准曲线扩增图标准曲线：y=-3.3971x+27.313相关系数：R²=0.9996标准曲线实时荧光PCR法灵敏性检测融解曲线讨论1鉴定结果准确，但步骤繁琐，耗时4～7d2不需要特殊仪器，操作方法简便，但只能用于鉴定单个细菌的纯培养物，结果判定依赖于操作者的肉眼判断3快速、准确，操作步骤简便，人为因素的影响小，但是鉴定时需要纯培养，对菌悬液的制备和浓度也有要求讨论4检测范围广，耗时短，不需要样品前处理和纯化，且稳定性高，但需要特殊的仪器和设备，使用成本高5简便、快速、对标本的纯度要求低,但容易出现气溶胶、样品间的交叉污染，死活菌不能区别，产生假阳性结果6比常规PCR更加灵敏，更加的快速。但此方法对酶的活性、引物特异性要求高，检测费用昂贵讨论六种方法都有各自的优缺点，单一的检测方法总是有其难以解决的困难，针对传统方法的缺点，实验中摒弃了传统的生化鉴定程序，结合API20法和Vitek法别对沙门氏菌进行生化鉴定，这不仅减少了生化鉴定前的实验准备，而且缩短了传统鉴定的时间。针对PCR法出现气溶胶、样品间的交叉污染，死活菌不能区别，产生假阳性结果的不足，我们可以引进美国的一种新检测方法，在检测样品中添加一种染料，这种染料可以被死亡的沙门氏菌吸收。这种新的PCR法保留了PCR检测快速、敏感、特异的优点，同时避免了可能产生假阳性的缺点。讨论在试图减少检测时间方面，美国科学家RFerretti用沙门氏菌在缓冲蛋白胨水BPW中非选择性增菌6h，再进行细菌DNA提取和普通PCR实验，此方法仅用时12h。在实时荧光PCR中引入此方法，缓冲蛋白胨水增菌6h，45min水煮法提取DNA，实时荧光PCR30min，在8h内就能检测出沙门氏菌。讨论传统的方法结合API20E和Vitek法对一般细菌的检测都能做到直接、快速和准确。当有大量的待检样品时，VIDAS法可以快速、准确的判断出细菌的阴阳性，再结合传统方法进行检测，即节省了时间又避免了假阳性、假阴性对检测的影响。当某地区发生突发性的细菌病时，采用实时荧光PCR法可在8h内检测出细菌的阴阳性，再结合血清学鉴定，为细菌病的治疗、防控奠定了基础。致谢感谢教授悉心指导。感谢甘肃省出入境检疫检验综合技术中心给予我这次实习的机会，感谢老师和师姐在实验过程中和的教导，让我真正感觉到我们专业的作用，同时也增长了不少的专业知识和兴趣。感谢动物医学院所有老师的细心教导，以及大学4年来对我的帮助和关心。