沙门氏菌的检验

全国食品卫生标准委员会微生物标准协作组2008年11月14日-18日食品卫生微生物学检验（GB/T4789.4）修订背景国内外方法修订内容前增菌选择性增菌分离平板生化鉴定血清学鉴定报告回顾一下食品卫生微生物学检验标准的制定，经历了从无到有，从事该领域的工作者，花费了巨大的心血，先后制修订了84版、94版、和2003版的检验标准，每版的标准，都为该年代的食品卫生工作提供了巨大的技术支持，同时也深深地烙上了该时代的经济特征。由于食品生产及流通的全球化、新的食品加工技术的应用、东西方饮食习惯的交融、自然环境的改变等因素的影响，目前沙门氏菌污染的食物种类、季节及场所发生了重大变化。同时，随着检测技术的发展，对于沙门菌的快速检测方法层出不穷，有些方法已通过国际权威机构认证（如AOAC）成为了国际标准方法。1.修订任务由卫生部全国食品卫生标准委员会下达，由微生物标准协作组具体实施。2.兄弟单位、企业、公司为参与单位。3.共采集到数据800多个，专家反馈意见50余条（采纳90%以上）条，形成标准的草案稿、送审稿。4.时间跨度2004年—2006年结合目前的国际标准和原标准的实际使用情况，针对原标准的修订，我们遵循以下的修订原则：1．以原国标为基础，保持与原标准的连续性；2．参照国际分析协会（AOAC）、国际标准组织（ISO）及美国食品药品管理局（FDA）的有关标准；3．结合标准的比对实验和验证实验，积极吸取新方法、新技术，修订标准。1.GB/T4789.42.AOACOfficialMethod：967.26，967.27，967.283.ISO：65794.USFDA：BacteriologicalAnalyticalManual,Chapter5:Salmonella。1前增菌；2选择性增菌；3分离；4生化鉴定；5.血清学鉴定；6.报告。国家标准USFDAFSISAOACISO冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2003样品（20类）25g225mL乳糖肉汤（LB）or胰酪胨大豆肉汤（TSB）or煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or再造脱脂奶粉or四硫酸盐煌绿（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT43±0.2℃or35±2.0℃24±2h24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙门菌沙门菌非沙门菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐（API20E,EnterotubeII,EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）+O抗原&H抗原细菌学分析手册（FDA/BAM）USDA/FSISMLG4.02样品BPWorBPW（含结晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统or传统生化鉴定报告结果AOACOfficialMethod967.25SalmonellainFoodsPreparationofCultureMediaandReagentsAOACOfficialMethod967.26SalmonellainProcessedFoodsDetectionAOACOfficialMethod967.27SalmonellainFoodsIdentificationAOACOfficialMethod967.28SalmonellainFoodsSerologicalTestsAOAC967.25－967.28处理样品沙门菌1mL+10mLSC1mL+10mLTT35℃24±2hXLD&HE&BS35℃24±2h（BS24h&48h）35℃24±2hTSI&LIA35℃24±2h纯培养物不纯培养物纯培养物MACorXLDorHE尿素酶－尿素酶＋非沙门菌H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原非沙门菌补充生化试验酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐非沙门菌25g样品225mLBPW35℃or37℃16~20h0.1mL+10mLRV10mL+100mLSC42℃24h35℃or37℃24h,48h酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）&第二种选择性平板35℃or37℃20~24h无典型菌落再培养18～24h典型菌落（pinkred）营养琼脂纯化可疑菌落35℃or37℃18~24hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚血清学试验（O抗原，Vi抗原，H抗原）报告结果送参考实验室分型ISO6579:1993(E)微生物－沙门菌检测的通用方法1前增菌2选择性增菌3分离4鉴定5报告检样36℃±1℃，8h～18hTSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素(pH7.2)，KCN挑取可疑菌落BSXLD（或HE、科玛嘉显色培养基）1mL+TTB10mL1mL+SC10mL25g（mL）样品+225mLBPWH2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-反应结果与左侧描述不符商品化生化鉴定系统42℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，40h～48h36℃±1℃，18h～24h甘露醇+、山梨醇+ONPG-报告非沙门氏菌沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌检验程序1取消样品分类，前增菌液统一为“缓冲蛋白胨水”原国标：BPWFDA、AOAC：多种前增菌液ISO：BPW2对所有样品均进行8-18h前增菌原国标只对冻肉、乳品、蛋品等加工食品进行前增菌，FDA、AOAC、ISO、CanadaMFHPB、CCFRA等组织或国家对所有样品都进行前增菌。3修改了样品处理方式增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。4增加调整pH值1使用“TTB、SC”，取消“MM”原国标：“MM或TTB、SCAOAC：TT、SCFDA：RV、TTISO：RV、SC选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。使用BS、XLD、HE、科玛嘉显色培养基原国标：BS、DHL（或HE、WS、SS）FDA：BS、XLD、HEAOAC：BS、XLD、HEISO：phenolredbrilliantgreen琼脂、BS或HE为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。I-SS65.3I-SS-M81.0C-SS52.0I-HE83.2C-HE80.0I-XLD83.0C-XLD86.2I-BS106.6C-BS77.7CHRO68.4C-DHL98.4C-WS71.6TSA（对照）100.0I：进口C：国产C-BSI-BSC-HEI-HEI-XLDC-XLD（变形菌落-错误）1）采纳API20E或VitekGNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。2）生化鉴定项目进行调整原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基；现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了API20E或VitekGNI鉴定的需要。2）生化鉴定项目进行调整（续）为保持与原标准的一致性，本标准也保留了可以同时直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、KCN培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查，这对生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非常必要的。第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数结果判定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX124124124124124124124反应结果-+++++-----+++++-+-+-沙门菌应得树枝024124000004124104020组合编码6704752沙门氏菌20E鉴定结果布氏柠檬酸杆菌20E鉴定结果河生肠杆菌20E鉴定结果应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。1血清学鉴定中的菌体分群为选择性试验项目原国标进行O抗原、H抗原鉴定及菌体分群；FDA、AOAC进行O抗原、H抗原鉴定，菌体分群为选择性；ISO进行O抗原、H抗原鉴定。综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌。选择性增菌液的配置分离培养基的质控疑似菌落的挑选API20E结果判读血清质量VIDAS（生物梅里埃公司）BAX（杜邦公司）VIDAS应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。DUPONTQualiconBAXSystem应用DNA分子核酸探针或基因探针技术制造的全自动PCR分析仪。将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。