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光镊技术的新应用纪美伶，白中博，王娜，马学进（西安交通大学生物医学工程）摘要激光光镊自从1986年发明以来，作为一种无直接接触、无损伤、可产生和检测微小力以及精确测量微小位移的物理学工具，在生命科学等多个领域得到了广泛的应用。本文从光镊的诞生出发，简要讨论了光镊的原理，光镊装置的基本结构，并简要介绍了各个种类光镊的独特功能以及基于光镊的一些新技术，进而对光镊技术及其在生命科学中的应用现状和进一步发展作了评述和讨论，阐述了光镊在生命科学研究中的潜在地位和巨大的发展前景。关键词光镊；生命科学；原理；基本结构；应用现状；发展NewApplicationsofOpticalTweezerJiMei-ling,BaiZhong-bo,WangNa,MaXue-jinAbstractTheopticaltweezertechniquehasemergedasaflexibleandpowerfultoolforexploringavarietyofscientificprocessessuchaslifesciencesinceitwasinventedin1986.Fromthebirthoftheopticaltweezer,thispaperwillbrieflydiscussitsworkingprinciple,itsbasicstructureandintroducesomekindsofopticaltweezerswithnovelfeaturesorsomenewtechnologiesbasedonit.Thenitsrecentdevelopmentsonboththetechnologyandapplicationsinlifesciencewillbereviewed.Itisshownthatopticaltweezerwillhavegreatpotentialinlifescience.Keywords：opticaltweezer;lifescience;principle;basicstructure;application;development光镊简介一百年前，爱因斯坦提出的光量子学说最终导致了激光的诞生，20世纪60年代激光器的发明，使光与物质相互作用产生的力学效应真正走向实际的应用。20世纪70年代，美国贝尔实验室的学者ArthurAshkin等人[1]发现了激光具有移动微粒的能力，并首先提出利用光压操控微小粒子的概念：在氩离子激光器发出的TEM00模式激光束作用下，硅小球在横向梯度力的作用下陷入光束中心，然后在光束散射力的作用下沿着光束传播的方向加速运动；还发现了折射率低于周围介质的粒子（气泡）会被激光束排斥，同时也会被激光束沿着激光传播的方向加速。其后Ashkin利用两束相对照射的TEM00模式激光去捕获高折射率粒子，发现粒子在激光横向梯度力的作用下陷入光束中心，然后沿着光束传播的方向运动到一个稳定的平衡点停止下来，这样粒子就被两束相对照射的激光束稳定捕获了。这时它还不能称之为光镊，因为只能实现横向二维捕获，而在轴向上由于强烈的散射力的存在无法实现捕获。1971年，Ashkin和Dziedzic第一次使用了单光束捕获粒子[2]。他们利用一束聚焦的TEM00模式激光从下向上照射粒子，在轴向散射力的作用下粒子被顶起，同时粒子受到向下的重力作用。当粒子运动到平衡位置时，向上的散射力和向下的重力达到平衡，粒子在轴向上稳定下来。在横向上，由于光束的横向梯度力始终指向光束中心，因此粒子被稳定地捕获在光束中心。这样就形成了一个单光束悬浮光阱（opticallevitationtrap）。在1986年，Ashkin发表了一篇具有深远意义的论文[3]，标志着光镊的诞生。在此文中Ashkin仅仅利用一束激光就实现了在三维方向上捕获电介质粒子，而且在轴向上利用的是梯度力捕获粒子，而非利用重力作用的悬浮光阱。实验中Ashkin利用高度聚焦的单光束焦点形成的单光束梯度力势阱（singlebeamgradientforcetrap），在水中成功地捕获了直径从25nm到10μm的电介质粒子，且在横向和轴向上所施加的捕获力都来自于光场梯度力。由于这种单光束梯度力势阱在轴向上的梯度力足够大，超过了散射力，占据了主导地位，形成了一个稳定的三维势阱，可以像一个镊子一样任意捕获并移动电介质粒子，可以在基本不影响周围环境的情况下对捕获物进行亚接触性、无损活体操作，因此又被形象地称作光镊（opticaltweezers）。近30年来光镊技术的研究和应用得到了迅速的发展，由于其在捕获操纵粒子时具有非接触性、无机械损伤、精确定位等特点，使光镊在各个领域，特别是生命科学领域，已成为研究单个细胞和生物大分子行为不可或缺的有效工具[4]，在生物分子的操控和生物分子的动力学研究方面发挥了重大作用，正逐步成为研究活体生物功能内在机制和疾病诊断、治疗的重要工具。因此，本文将光镊的基本装置、分类及其在生物科学领域的应用等方面作简单介绍与系统地综述。基本原理光具有能量和动量，携带动量的光与物质相互作用时会有动量的传递，从而表现为光对物体施加一力，并由此引起物体的位移和速度的改变，称之为光的力学效应。如图1所示，一束激光被透镜聚焦后射到透明介质球上，经介质球两次折射后，光子动量发生变化，这种变化反作用于小球，表现为对小球的反作用力，该力的大小正比于光的强度梯度，合力F方向指向光束焦点。这种由于光场强度分布不均匀而产生的力，称为梯度力。光镊是依靠光的梯度力形成的，当达到焦点附近的梯度力大于散射力时才能形成一个稳定的三维光学势阱来稳定地捕获生物粒子，这一稳定的三维光学势阱是由一束激光通过一个短焦距透镜汇聚来实现的。由图1可知，无论入射光从法线之上还是之下入射小球，小球受到合力方向均指向焦点（f）中光场梯度力指向焦点位置，因而可被稳定捕获，并进而实现对它的操控。图1电解质小球的光捕获机理示意图[4]当光束a和b经透镜折射，其折射光产生的力分别为aF和bF，合力F指向焦点f。无论a、b两束光从法线之上（A）还是之下（B）入射，电解质小球所受合力方向均指向焦点基本组成装置光镊系统通常是由激光光源、激光扩束滤波光路、光镊移动控制环节、位移检测传感部分和传统光学显微镜组成，再配上CCD和计算机，用来观察、监测和记录实验过程[5]。光镊的简易结构如图2所示。图2光镊实验装置简易图[7]BE为beamexpander，即激光扩束；MO，microscopeobjective，物镜；DM，dichroicmirror，分光镜，样品至于载物台上。激光光源为半导体激光器，激光光束经显微镜内的一片双向分束器反射，进入100倍油浸物镜，再会聚到观测点上形成光镊。图像被一个极敏感的CCD摄像机准确的记录以及传输到电脑端显示。样品池置于自动或手动操纵平台上，自动操纵平台由计算机控制其在三维方向以微米精度运动，通过控制自动平台使被捕获粒子相对于样品池移动，从而实现对粒子的操控，所有的观察和测量都是在实验室的室温下进行的[8]。由光镊的基本装置可以看出，光镊对微粒的捕获和操作是无损的，不会干扰其正常活动，是研究生物微粒静态和动态力学特性的理想手段。光镊的分类经过近30年的发展，光镊技术得到了极快的发展。由过去简单的单光镊演化出了许多其他的类型，极大地扩大了光镊技术在现代科学技术领域的应用。（1）多光镊系统（又称阵列光镊）对于生物微粒，常常需要研究它们彼此之间的相互作用，因此为适应相关的复杂操控的需要，多光镊技术产生并发展起来。多光束光镊是指一次可以形成多个光阱，同时捕获并操纵多个粒子的光镊。与一次只能捕获一个微粒的单光束光镊相比，多光束光镊不仅可以同时产生多个光阱，同时捕获并操纵多个粒子，而且可以实时控制光阱的排列位置，大大提高了实验效率，且使入射在微粒上的激光强度分散，降低了光损伤的可能性。目前已有多种产生多光束光镊的方法，其中研究最多的、应用的最为广泛的方法是全息衍射法（全息光镊）和分时复用法（扫描光镊）这两种方法。1）全息光镊全息光镊是利用光学衍射的方法产生多光点阵列。关键技术在于光学衍射元件（DOE）的应用。一般来说，用作全息光镊的光学衍射元件是空间光调制器（SLM）上加载的计算全息图（CGH），应用最多的是液晶空间光调制器。图3中的装置就是采用反射式液晶空间光调制器。其基本原理是通过计算机产生的全息图加载到空间光调制器上，激光束经扩束准直后入射到空间光调制器上，经衍射被调制成为所需要的光强分布，再通过一个望远镜系统将光束收集进入显微物镜，在显微物镜的焦平面上得到所需要的光点阵列。每一个光点相当于一个光学势阱，从而可以同时并行地捕获和操作多个微粒，通过编程改变全息图来改变光点阵列的结构。因为采用SLM可以产生排列变化的光阱阵列，所以又称其为动态全息光镊。动态全息光镊的光学捕获和操控性能仅受SLM的光学特性和所产生的全息图计算时间的限制。图3全息光镊装置[9]根据不同的全息图记录方式，全息光镊有两种光路：菲涅耳型光路和傅里叶型光路，如图4所示[9-10]。菲涅耳型光路使用的全息图是菲涅耳全息图，是在被照明物体的菲涅耳衍射区内记录的；傅里叶型光路使用的是傅里叶全息图，记录位置位于傅里叶变换平面。（a）（b）图4全息光镊的两种典型光路[10-11]：（a）傅里叶型光路；（b）菲涅耳型光路图5给出了Jesacher等人利用全息光镊产生的圆形、椭圆形、五边形、笑脸等一系列复杂光阱，并成功地捕获了多个粒子，使其在光阱中做逆时针运动。图5全息光镊产生的阵列光阱[12-13]从上到下：傅里叶平面光场分布、物镜焦平面光场分布、被捕获粒子在光阱中的运动方向2）分时扫描光镊技术全息光镊受空间光调制器透过率及衍射效率的限制，通常需要使用瓦级的大功率激光器才能产生足够强度的多光阱阵列。与之相比，分时扫描光镊由于采用单光束扫描在光束偏转器的作用下，在焦平面上快速扫描，以达到多光束的效果，所以光强损失小，可以使用较低功率的激光器。分时扫描光镊的核心部件是光束偏转器来实现光束的高速偏转。激光束经过偏转器在显微物镜的像平面上快速扫描，通过计算机控制光束的行走路径，也可以使激光束在几个固定点之间快速切换。当光点在各个微粒上的作用时间大于最小停留时间，而离开时间小于粒子的布朗运动时间时，粒子可以被束缚在光点扫描路径上，排布成各种图案，或者在几个固定点上同时捕获粒子。通过控制光束的扫描速度，还可以使被捕获的粒子沿光束的扫描轨迹运动。图6扫描光镊示意图[14]分时扫描光镊的缺点是可同时捕获的粒子数目不多。当需要同时捕获的粒子数很多时，这种方法就不适用了。扫描光镊的另一个缺点是不能产生三维光点阵列。美国Illinois大学的Timp教授[14]对这种方法进行了改进，使用高速的声光偏转器产生21×21的二维光点阵列，同时捕获了441个Pseudomonasaeruginosa细胞。他们将扫描技术与空间光调制器技术相结合，产生了3×3×3的三维光点阵列，可同时捕获27个细胞，在空间排列成方阵，用来研究细胞间信号传递。他们的方法是使用高速的声光偏转器先在平面上扫描出3×3的二维点阵，再通过计算机控制空间光调制器使其相当于一个菲涅尔透镜，沿光束传播方向产生三个焦平面，从而得到3×3×3的三维光点阵列，如图7所示。由于声光偏转器和空间光调制器都可编程控制，因而可以产生任意结构的二维或三维光点阵列。图7使用扫描技术与空间光调制器技术相结合产生的三维光点阵列捕获细胞[15]（2）光纤光镊利用光纤传输激光具有在短程内损耗很低的优势，且出射的激光光场仍然呈现一定特性分布[15]。光纤光镊是指用光纤代替显微物镜形成会聚光束，用光纤头出射具有高度光强梯度分布的光束来捕获粒子的光镊[16]。与传统的光镊不同，光纤光镊不需要扩束镜对激光束扩束，也不需要显微物镜对激光束聚焦，捕获系统的光路与光学成像光路相互独立，且结构比较简单，光纤头通过机械装置控制，可以插入样品溶液中对粒子进行近距离的操纵，适合用于生物活体组织、浑浊溶液等传光性不好的