凝胶色谱

凝胶色谱法•凝胶色谱法是一种新型的液体色谱•(GelPermeationChromatography简称GPC)•别名：体积排除色谱(SizeExclusionChromatography简称SEC)•凝胶过滤色谱(GelFiltrationChromatography简称GFC)等。•应用化学凝胶色谱法概述•凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。•它具有一系列优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。一、基本原理•小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠Waters1515型凝胶渗透色谱仪二、凝胶过滤介质•理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。1.葡聚糖凝胶•葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。2.琼脂糖凝胶•琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.5～9，温度0～40℃。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。3.聚丙烯酰胺凝胶•是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的。其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH2~11范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。三、凝胶过滤色谱柱和溶剂的选择色谱柱：每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配的色谱柱。溶剂的选择：能溶解多种聚合物不能腐蚀仪器部件与检测器相匹配四、实验技术•1.层析柱•层析柱的体积和高径比与层析分离效果的关系相当密切。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞。2.凝胶的选择•根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好，脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。3.凝胶的制备•商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。4.样品溶液处理•样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4%，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30%。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。5.洗脱与收集•为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。五、凝胶色谱的应用1）高分子与低分子同时测定•由于小分子和高分子的流体力学体积相差较大，因而GPC可以同时分析而不必进行预先分离，一般来说从高分子材料的GPC可以同时看到三个区域：•A:高分子B:添加剂和齐聚物C：未反应的单体和低分子的污染物如水。•①环氧树脂中树脂和齐聚物的同时分析•普通双酚A型的环氧树脂有很宽的分子量范围，包括低分子量的，中等分子量的，高分子量的产品。GPC能快速可靠的鉴别不同类型环氧树脂的分子量特性。•下图是三种不同分子量的GPC谱图，图上数字代表不同的聚合度n，树脂和齐聚物的峰形特征可用作指纹图，以区别不同厂家和批号的产品。•②高分子材料中小分子的定性鉴别•和其他色谱方法一样，GPC也可以用保留体积来鉴别或分离后用IR等方法鉴定中小分子物质。这里介绍一种便利方法。如果能预测某未知峰属于某种化合物，则将该化合物加入该试样中，比较前后的谱图变化，如果未知峰强化，则很可能就是该物质。•2）在高分子材料生产过程中的检测•①丁苯橡胶在塑炼时分子量分布的变化•在塑炼过程中定时取样分析，结果如图，随时间的增加，高分子量组分裂解增加，GPC曲线向低分子量方向移动，经过25min以后，高分子量组分几乎完全消失。如果塑炼的目的就是消除该组分，那么25min足够了。通过GPC数据可以帮助工作人员确定塑炼时间。•②控制聚合反应的终点•用GPC对聚合物进行中间反应分析，使生产人员能在达到预定的单体/聚合物比后即时中止反应文献引用•凝胶色谱法测定头孢地尼的聚合物-中国抗生素杂志-2011年第3期(36)•凝胶色谱法测定头孢丙烯及其制剂中的高分子杂质-中国抗生素杂志-2011年第9期(36)•凝胶色谱法--《微生物学通报》1978年03期•凝胶渗透色谱法-有机分离分析_马志Thankyou