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实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变(20,42,52,53)。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究(50)。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）(49)。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一(49,51)。1．原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)(20,42)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1）。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。（图1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA片段共有3个解链区域。MD1是解链温度最低的一个解链区域，MD3是温度最高的一个解链区域。）MD1MD2MD3图1：DNA片段解链区域示意图不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE/TGGE时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开(52,53)。当用DGGE/TGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerasechainreaction）扩增技术，用PCR扩增的16SrRNA产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16SrRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE分析。DGGE/TGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的PCR扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度或温度梯度（图2）。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA片段最低的解链区域时，DNA的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA片段在垂直胶中染色后呈S形的曲线，如图2所示。根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品，如图3所示。图2：垂直胶（太原焦化厂活性污泥16SrDNAV3区PCR扩增产物）图3：水平胶（太原焦化厂两个嚗气池活性污泥16SrDNAV3区扩增产物）在用水平电泳分析样品之前，先要优化确定电泳所需时间。一般采用时间间歇（timetravel）的方法，即每隔一定时间加一次样品，从而使样品的电泳时间有一个梯度，如图4所示。根据这个结果，确定最佳的电泳时间。图4：时间间歇(timetravel)（太原焦化厂活性污泥16SrDNAV3区PCR扩增产物）通过各种染色方法可以看到DGGE/TGGE胶中的DNA条带。最常用的几种染色方法是溴化乙啶（ethidiumbromide,EB）(51)，SYBRGreenI(51),SYBRGold(68)和银染法(66)。EB法染色的灵敏度最低。SYBRGreenI和SYBRGold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色时，双链DNA能很好地显色，单链DNA基本上不能显色。银染法的灵敏度最高，它不但能染双链DNA，也能染单链DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析(51)。2．PCR-DGGE/TGGE在微生物生态学中的应用PCR-DGGE/TGGE技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组成。Muyzer等人于1993年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性(50)。此后，该技术被广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤(24,27,72)，活性污泥(13,87)，人体和动物肠道(71,94)，温泉(18)，植物根系(72)，海洋(76)，淡水湖(69)，油藏(86)等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的16SrRNA基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也有用真菌的通用引物扩增18SrRNA基因(24)，从而研究真菌的群落多样性。除了通过核糖体RNA基因来分析微生物群落结构外，还可以通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。氨单加氧酶（ammoniamonooxygenasegene，amoA）基因被用来研究氨氧化菌群(54)；[NiFe]氢化酶基因被用来研究硫酸盐还原菌群(88)；多组分苯酚羟化酶大亚基基因（thelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase,LmPH）被用来研究降酚菌群(87,91)。PCR-DGGE/TGGE技术的另一大优点是能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程(49,51)。除了上述两个主要用途外，PCR-DGGE/TGGE技术还有很多其他用途。它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响(67,85)；可以检测单个纯菌rRNA基因的微异质性(55)；可以用来比较不同的DNA提取方法(51)；另外，它还可以辅佐筛选克隆文库(39)以及检测PCR和克隆过程中的偏差(37)。我们实验室用PCR-TGGE技术研究了多个微生物生态系统的微生物群落，包括处理工业焦化废水的活性污泥系统(92,95)，人体肠道(89)，动物肠道（猪，熊猫，昆虫），人体口腔，纤维素降解土壤，油藏系统等。另外，我们还研究了处理工业焦化废水的活性污泥系统中苯酚降解菌群(91)和氨氧化菌群的功能基因多样性。3．DGGE/TGGE技术的缺陷及优化在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体RNA拷贝数不同(16)；提取基因组总DNA时细胞的裂解效率不同(59)；DNA提取和纯化时有偏差(43,44)；PCR扩增过程中有偏差(34,61,63)。除了这些，在应用DGGE/TGGE技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。DGGE/TGGE一般只能分析500个碱基对以下的DNA片段(52)，因此得到的系统进化相关的信息就很少。在研究复杂环境生态系统（如土壤，人体肠道）时，其中微生物种类很多。但DGGE/TGGE图谱中一般只有一二十个条带，这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占1%以上的种群才能被检测出来(50)，系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先根据GC含量的不同，将基因组总DNA分成各个部分，再分别PCR-DGGE/TGGE分析(28)。另一个方法是使用类群特异性（group-specific）引物对基因组总DNA进行PCR扩增，再用于DGGE/TGGE分析(39,56)。在设计PCR引物去扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高，因此需要设计简并性引物。此时，相同的微生物会有2个条带，这会对微生物群落结构组成造成高估(39)。另外，同一个细菌也可以有多个核糖体RNA操纵单元，它们的序列可以有微小差异(55)，这也会高估微生物群落多样性。DGGE的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱也会有差异(70)。在应用DGGE时，如果所用电压太低，需要的电泳时间就很长，变性剂梯度会有变化，因此导致图谱也会有变动。另外，DGGE/TGGE的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。以前研究DGGE/TGGE胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16SrRNA克隆文库，然后再对文库中的克隆进行扩增，通过DGGE/TGGE和原始样品的条带进行对比，能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列(94)。然而，已有研究表明，不同的DNA条带在DGGE/TGGE胶中可以迁移到相同的位置(32,39,68,82)，因此单一DGGE/TGGE条带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。另一个研究DGGE/TGGE胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序(39,68,74)。现在越来越多的研究人员采用后一种方法。然而，PCR过程中产生的异源双链（heteroduplex）和单链DNA（single-strandedDNA）也会对分析单一条带序列造成偏差。人们已经普遍意识到异源双链DNA会在DGGE/TGGE胶中产生虚假条带(19,73)，然而对单链DNA造成的偏差还没有引起足够的重视(38,74)。我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污泥为研究对象，详细地分析了单链DNA在分析TGGE胶中单一条带序列组成时所造成的影响，发现它会大大高估单一条带中的序列多样性(92)。另外，我们还对比了3种去除单链DNA的方法，发现变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturedpolyacrylamidegelelectrophoresis,d-PAGE)纯化的效果最好（图5）。我们建议在进行DGGE/TGGE电泳之前，尤其是要分析单一条带序列时，要先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行纯化，然后再走电泳(92)。A12341234BabcdefghijkA:300VhrB:600Vhr1:PCR扩增产物(30cycles)2:PCR扩增产物(30cycles)+re-PCR3:PC