第六章 黄酮类化合物

第五章黄酮类化合物Flavonoids概述黄酮类化合物多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。基本结构：以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要是指基本母核2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物，现在则是泛指两个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架特征。OO12345678OO123456781'2'3'4'5'6'OO123456781'2'3'4'5'6'色原酮2－苯基色原酮C6－C3－C6概述生物合成•黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。COOHOOHHOOHOPCH2CCOOHCHOCHOHCHOHCH2OP赤藓糖-4-磷酸酯COOHHOOHOHCOOHOOHCOOHOPCH2CCOOHHOOCHOCH2COCOOHHOCOOHOHOCOOHNH2COOH去氢奎宁酸莽草酸分枝酸予苯酸苯丙氨酸酪氨酸NH2COOHOHHOCOOHRHOCOOHOglcCOOH桂皮酸对羟基桂皮酸HOOglcCOOHHOOO香豆素OOOOOOHORAoCSOCOOOHOHOOHROHOHOCOOHHOHOOROHO查尔酮黄酮类木脂（质）素第一节结构分类根据中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类。（一）黄酮类（一）黄酮类以2-苯基色原酮为基本母核，3位无含氧取代A环5,7位几乎同时带有羟基，而B环4’位常有羟基或甲氧基，3’位有时亦有。黄芩苷（二）黄酮醇类黄酮基本母核3位含有羟基或其他含氧基团。槲皮素R=H芦丁R=芸香糖（三）二氢黄酮类黄酮基本母核2，3位双键被氢化。（四）二氢黄酮醇类黄酮醇的2，3位双键被氢化，常与黄酮醇共存于同一植物。（五）异黄酮类母核为3-苯基色原酮；B环连接在C环的C-3位。（六）二氢异黄酮类异黄酮的2，3位双键被氢化（七）查耳酮二氢黄酮C环的1，2位键断裂生成开环衍生物，即三碳链不构成环。红花苷（八）二氢查耳酮查耳酮α，β双键氢化。（九）橙酮类C环为含氧的五元环。（十）花色素类C环无羰基，1位氧原子以烊盐形式存在。（十一）黄烷醇类C环的3位或4位存在羟基，常分为黄烷3醇（儿茶素）和黄烷3,4二醇（无色花色素类）。（十二）shan酮类苯并色原酮，母核由两个苯环与色原酮的2,3位骈合而成。（十三）双黄酮类两分子黄酮、两分子二氢黄酮或一分子黄酮与一分子二氢黄酮以C-C或C-O-C键连接而成。存在形式多以苷存在：O-苷和C-苷糖的种类：单糖：D-葡萄糖，D-半乳糖，D-木糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖醛酸双糖：槐糖，龙胆二糖，芸香糖（Rha1—6Glc），新橙皮糖（Rha1—2Glc）等三糖：龙胆三糖，槐三糖酰化糖：2-乙酰葡萄糖，咖啡酰基葡萄糖常见取代基OH，OCH3，CH3，异戊烯基，甲二氧基取代位置OH，OCH3等含氧基团：A环：5，7位B环：3’，4’位非含氧基团：A环：6，8位B环：2’，3’位第二节理化性质与检识一、性状，色泽性状：多为结晶，少数为无定形粉末。颜色：交叉共轭系统及羟基、甲氧基等助色团黄酮（醇）及其苷类呈灰黄-黄色查耳酮：黄-橙色二氢黄酮（醇）：无色异黄酮：微黄色花色素及花色苷：红色（pH7），紫色(pH8.5)，蓝色(pH8.5)二、溶解度游离苷元：难溶于水，易溶于甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚等有机溶剂中苷：溶于水、乙醇、甲醇中，难溶于苯、氯仿水溶度：羟基越多，水溶性大；苷元苷，糖链越长，水溶度越大；3-羟基苷7-羟基苷。黄酮（醇），查耳酮二氢黄酮（醇）花色素平面型分子非平面型分子离子水溶性水溶性：花色素二氢黄酮（醇）异黄酮黄酮（醇）、查耳酮三、酸碱性（1）酸性•多具有酚羟基，故显酸性，酚羟基数目不同及位置不同，酸性强弱也不同。•7，4’-二羟基7-或4’-OH一般酚OH5-OH碳酸钠碳酸氢钠氢氧化钠（2）碱性•γ吡喃环上的1-氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性。可与强酸成不稳定的盐。三、酸碱性四、显色反应（一）还原显色反应颜色反应多与分子中的酚羟及γ-吡喃酮环有关。1.盐酸-镁粉（或锌粉）反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）显橙红-紫红色，少数显紫-蓝色。查耳酮、橙酮、儿查素：阴性；异黄酮：个别阳性、大多显阴性；花色素、部分橙酮、查耳酮在浓盐酸作用下显色，需做对照2.硼氢化钠（钾）反应为鉴定二氢黄酮（醇）类化合物专属颜色反应（红色-紫红色）。（二）金属盐类螯合反应1.三氯化铝显色反应显黄色并有荧光；4’羟基或7,4’羟基黄酮醇显天蓝色荧光。5-羟基、4羰基3-羟基、4羰基邻二酚羟基2.锆盐-枸橼酸显色反应鉴别3-羟基或5-羟基黄酮类化合物。络合稳定性：3-羟基、4-酮基5-羟基、4-酮基，加枸橼酸，5-OH黄酮褪色，3-OH黄酮仍呈鲜黄色OOOHOOHOHHOZrClH2O3.乙酸镁显色反应常用醋酸镁钾溶液为显色剂，二氢黄酮(醇)类可显天蓝色荧光，黄酮(醇)及异黄酮类等则显黄-橙黄-褐色。4.氯化锶显色反应在氨性甲醇溶液中，可与分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色-棕色乃至黑色沉淀。（三）硼酸显色反应鉴别5-OH黄酮或2’-羟基查耳酮类结构（亮黄色）。（四）与碱性试剂显色反应1、二氢黄酮类（橙-黄色）2、黄酮醇类在碱性中先呈黄色，通入空气后变为棕色，据此可与其它黄酮类区别。3、黄酮有邻二酚羟基或3，4’-二羟基，易被氧化，由黄色→深红色→绿棕色沉淀。五、层析法1、纸层析苷元：分配层析。流动相：BAW系统（正丁醇-乙酸-水，4:1:5，上层）苷：双向纸层析。第一向：醇性溶剂展开，如BAW系统，化合物极性大，吸附强。第二向：水类溶剂展开，如：2-6%醋酸水，化合物极性大，吸附弱。一次二次双糖苷单糖苷苷元苷元单糖苷双糖苷2、薄层层析（TLC）主要指吸附薄层，常用硅胶TLC，聚酰胺TLC。硅胶TLC：鉴定弱极性化合物。展开剂：分离苷元：甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5:4:1）分离苷：乙酸乙酯：-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1）聚酰胺TLC：分离大多数黄酮及苷类（有游离酚羟基）第三节黄酮类化合物的提取与分离一、提取1.粗提物的制备苷元可选乙醚、氯仿乙酸乙酯等中强极性的溶剂；苷可选用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水。2.溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些药料水溶液则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。3.碱提取酸沉淀法黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个方法。兹以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。槐米（槐树SophorajaponicaL.花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此pH条件下微沸20-30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎1次，趁热抽滤。合并滤液在60-70℃下，用浓盐酸调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至中性，60℃干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，70-80℃干燥得芦丁纯品。槐花米粗粉（20g）碱提取在500ml烧杯中加入水250ml，硼砂1g[注1]在加热至沸腾时，投入槐花米，继续直火煮沸2~3分钟，在搅拌下小心加入石灰乳，调至8.5~9[注2]保持微沸30分钟，趁热用尼龙布挤过滤。滤渣滤液酸沉淀在60~70℃下用浓盐酸调pH至4[注3]。静置6小时以上析出沉淀。抽滤，用蒸馏水洗沉淀1~2次至中性。滤液沉淀（芦丁粗品）（弃去）粗称重后按芦丁在热水中1∶200的溶解度加蒸馏水进行重结晶。将沉淀悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15分钟，趁热过滤。滤渣（弃去）滤液充分静置，过滤，60~70℃干燥，称重。芦丁（精制品）在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成yang盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取，以使上述含羟基的杂质生成钙盐沉淀，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。注意事项二、分离依据：极性不同------硅胶、氧化铝（极性吸附）酚羟基数目、位置不同------聚酰胺（氢键）酸性不同------PH梯度分子量不同------凝胶柱层析特殊结构------化学方法1.硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。吸附规律：极性大吸附牢。如：A苷元B单糖苷C二糖苷Rf:ABC2.聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。洗脱剂：水乙醇甲醇丙酮氢氧化钠水溶液（氨水）甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液（洗脱能力依次增强）常用洗脱剂：水-乙醇，水可洗下非黄酮水溶性成分及少数黄酮苷；10-30%醇可洗下黄酮苷；50-95%乙醇可洗下黄酮苷元。聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物，从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律：（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：三糖苷双糖苷单糖苷苷元（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减缓（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇（4）分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。影响因素例1：用聚酰胺柱色谱分离下述化合物,以不同浓度的甲醇进行洗脱,其出柱先后顺序为OOOHOHHOOOOHOHHOOHOHOOOOOgluORhaOOOHOHOOCH3ABCD(C)→(A)→(D)→(B)例2：下列黄酮化合物（1）用聚酰胺柱色谱，含水甲醇梯度洗（2）用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，分别写出洗脱顺序。洗脱顺序：聚酰胺：DECBA硅胶：ABCDE3.葡聚糖疑胶(Sephadexgel)柱层析：对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex-G型及SephadexLH-20型。SephadexG适用于水系统SephadexLH-20适用于水及有机溶剂系统葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。分离黄酮苷时，则分子筛的属性起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体，葡聚糖凝胶柱层析中常用的洗脱剂有：(1)碱性水溶液（如0.1mol/LNH4OH），含盐水溶液(0.5mol/LNaCl等)。(2)醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水（不同比例）、正-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。(3)其它溶剂：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。4.梯度pH萃取法•分离酸性强弱不同的黄酮苷元•酸性：7,4’-OH7-或4’-OH一般OH5-OH溶于NaHCO3Na2CO3不同浓度的NaOH样品乙醚乙醚液依次萃取5%NaHCO35%Na2CO30.2%NaOH4%NaOH分别酸化各部分黄酮酸性减弱习题：从某植物中分离出四种化合物，其结构如下：•试比较四种化合物的酸性，•极性大小•比较它们的Rf值大小顺序：1）硅胶TLC，展开剂CHCl3-MeOH（9:2）2）聚酰胺TLC，60%MeOH/H2O3）纸色谱，15%醋酸-水AR1=R2=H3,7,4’-OHBR1=H,R2=Rha3,4’-O