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显微镜血球计数板计数法一、实验目的1、明确显微镜计数的原理。2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。二、实验材料酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管、吸水纸等。三、实验原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1㎜3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。推导：1mm×1mm方格的计数1mm×1mm表示计数室的边长，即一个大方格的边长。由于计数室厚度为0.1mm，所以计数室的总体积为0.1mm3。1．16×25型的计数公式：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数2．25×16型的计数公式：酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数假设：计数室内酵母菌为a个，稀释倍数为b，则10mL培养液中酵母菌总数为：a×105×b例4、通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数，应先▲后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有▲个。（参考答案：稀释；2×108）5×400×10000×10＝2×108。例6、在用血球计数板（2mm×2mm方格）对某一稀释50倍样品进行计数时，发现在一个计数室内（盖玻片下的培养液厚度为0.1mm）酵母菌平均数为16个，据此估算10mL培养液中有酵母菌▲个。（参考答案：2×107）四、操作过程1．稀释将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3．加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置5—10分钟即可计数。4．显微镜计数将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5.对每个样品计数三次，取其平均值，计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml12345第一室第二室A-五个中方格的总菌数B-稀释倍数6．清洗血球计数板血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。7.注意事项（1）实验过程中发现，如何稀释？如果发现每小格中酵母菌的个数多于10个，可按以下处理：取1ml酵母菌培养液加入到盛有9ml蒸馏水的试管中，摇匀，再计数；如发现酵母菌的个数仍然过大，则同样再稀释一次，直至每小格中酵母菌的个数介于5-10，并作记录。（2）调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。（3）因菌液在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下才能看全，所以，观察时必须不断调细螺旋（调焦距长短），方可找全。（4）每个样品重复2—3次，若两次差别太大应重测。