03微生物发酵菌种的选育与保藏

微生物发酵菌种的微生物发酵菌种的选育与保藏选育与保藏北京林业大学生物学院食品科学与工程系北京林业大学生物学院食品科学与工程系欧阳杰欧阳杰◇选育优良的生产菌种◇保持菌种稳定的生产特性◇确定最佳发酵工艺条件◇确定最佳提取工艺——高提取率◇环保？发酵工业中重要的工作发酵生产高效益优良的生产菌种最优发酵工艺最优提取工艺人工选育手段:◇自然选择◇人工诱变◇原生质体融合◇基因工程育种(1970s开始)野生型菌种优良菌种★菌种保藏:由于微生物在传代过程中不断产生变异，菌株选育获得的优良性状不可能永久地保持下去，只能是使这种退化速度尽可能减慢，就需要创造适宜的环境来限制退化的速度。发酵用酵母的形态主要内容11微生物发酵菌种的选育微生物发酵菌种的选育22菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮33国内外主要的菌种保藏机构国内外主要的菌种保藏机构1微生物发酵菌种的选育1.1微生物菌种选育的理论基础1.1.1微生物的遗传和变异遗传是相对的，变异是绝对的。有了变异，生物才能进化，才能适应变化着的环境。★微生物的遗传：亲代和子代生物学特性的传递过程，亲代的特性在子代中重现。子代所继承的这些特性，具有相对稳定性，可以较长期地保持下去。★微生物变异：在外界环境发生变化时，遗传性会发生变化，子代的某些特性如形态、代谢等与亲代有可观察到的，有时甚至是明显的变化，这就是变异。★微生物遗传和变异的特点：(1)微生物繁殖快，生活周期短，在相同时间内，环境因素可以相当大地重复影响微生物，使个体较易于变异，变异了的个体可以迅速繁殖而形成一个群体表现出来，便于自然选择和人工选择。(2)微生物个体小，比表面积大，大多以单细胞或极少分化的多细胞存在，环境可以直接影响细胞，易于引起细胞变异。当环境发生剧烈变化时，能发生变异的细胞适应这种环境而生存下来，成为变异菌株。(3)微生物大多是无性繁殖或以无性繁殖为主，而且营养体多数为单倍体，因此便于建立纯系及能长久保存大量品系，一旦发生变异，也能很快在性状上表现出来。„微生物的变异：◆稳定性变异◆不稳定变异◆稳定性变异：环境因素的改变影响到基本代谢过程的改变，使改变了的形态和生理特性保持下来，不能回复到变异发生前的状态；◆不稳定变异：变异是暂时的，当环境恢复到正常状况时，其形态和特性又能恢复原状，这种情况是由于环境的变化未能引起基本代谢过程的改变，因而这种变异是暂时的。1.1.2遗传变异的物质基础„1866年，Mendel的豌豆杂交试验„1910年，Morgan的果蝇实验„1897年，Miescher发现核酸孟德尔(G.J.Mendel)：现代遗传学的奠基者遗传学基本规律：◇分离定律◇自由组合定律遗传的不是性状，而是决定性状的因子！J.H.Morgan用果蝇为材料，确认遗传因子——基因(gene)存在于细胞核和染色体里1897年瑞典生化学家Miescher发现核酸，但他没有认识到核酸的重要意义。„微生物的3个经典实验：细菌转化实验烟草花叶病毒的拆合实验噬菌体的感染实验★遗传物质的分子结构和化学组成(1)遗传物质的化学组成核酸——核苷酸——核糖＋磷酸＋碱基DNA含A和G、C和TRNA含U而不含T1953年,美国生物学家J.D.Watson和英国物理学家F.H.C.Crick(2)遗传物质的结构DNA的双螺旋结构：揭示了天然DNA分子如何复制产生两个完全相同的分子，以及遗传信息如何变化而带来遗传突变的性质(3)DNA的复制半保留复制1.解链：两条多核苷酸长链之间连接碱基对的氢键断裂，两条链分开成单链；2.以母链为模板，进行碱基配对；3.每一条新链与原来的模板链通过碱基间氢键连接成一个新的DNA双螺旋分子。★遗传物质在细胞中的存在形式(1)真核生物DNA＋组蛋白染色体染色体外包裹核膜细胞核真核生物的染色体(2)原核生物DNA不与组蛋白结合，每个细胞中往往只有一个环状染色体，无核膜包被，DNA分子呈裸露状态。原核生物和真核生物染色体的区别(3)质粒(plasmid)：存在于细菌、酵母和放线菌中。非核染色体的共价闭环状DNA分子，具有自主复制功能，并带有某些特殊遗传性状。质粒的性质：„质粒与染色体同步复制，将新复制的质粒分配至子细胞中。„吖啶类染色剂、高温和表面活性剂可使质粒消除。„微生物失去质粒，则由质粒控制的性状也消失。„质粒据其所具有的性状分为：致育因子(F因子)耐药因子(R因子)有的还控制某些次级代谢产物如细菌素合成。„隐秘质粒：有一些质粒不显示任何表型效应，它们的存在只能通过直接观察而不是通过遗传学现象来观察。„质粒在细胞中的数量与其大小有关，分子量愈大，则质粒数愈少，反之分子量愈小，则质粒数愈多。„转移质粒：可从一种细菌细胞转移至另一细胞中„非转移质粒：质粒不能转移(4)基因与染色体„基因是一个含有特定的遗传信息的核苷酸系列，它是遗传物质的最小功能单位„基因决定着遗传信息的传递和性状的分化发育„基因一般在染色体上呈直线排列。„一条染色体上包含着无数基因，个别基因就是DNA特定部位的一小段碱基特有的排列次序。„根据基因的原初功能，基因可分为：编码蛋白质基因无翻译产物的基因不转录的DNA区段如启动区操纵基因„决定微生物遗传性状的是基因，微生物的表型受基因的控制;„只有基因发生改变，表型才能出现变化。„只有人为地改变DNA的结构，才能改变微生物的遗传特性，达到我们选育菌种的目的。1.2自然选育„自然选育——微生物菌种选育的经典方法。„它是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。„通过自然选育可达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。„自发突变中正变机率是很低的，选出更高产菌株的机率也很低。多数菌种产生负变异，其结果是使生产水平不断下降。„在生产中需要经常进行自然选育工作，以维持正常生产的稳定，选育高产菌种不是自然选育的主要目的。？？微生物菌种为什么会退化★菌种退化变异的原因⑴遗传基因型的分离微生物群体繁殖过程中往往会出现遗传基因型的分离。⑵自发变异的产生自发变异是不定向的，多数为负向变异，结果：目的代谢物产量下降生长速度变弱变慢孢子形成能力低下等◇菌体在长期传代中可能产生具有诱变作用的代谢物质，诱发DNA结构的改变。◇由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，这是一个缓慢渐变的过程。⑶人工诱变导致的退化变异诱变处理只使一个或少数几个细胞发生了基因突变，多数未突变的菌体由于分离现象的产生，逐渐占数量优势，其表现是产量下降。★自然选育的目的和适应条件:⑴进行菌种长期保存前，需进行自然分离，使菌种尽可能纯化。⑵通过人工诱变等选育到高产的优良菌株时，要及时进行自然分离，淘汰已发生回复突变的不良菌株，使稳定的高产菌株从中分离出来。⑶自然分离是用其他方法进行菌种选育时不可缺少的部分，只有配合使用自然分离，才能真正得到稳定的高产菌株。★自然选育的方法◇单细胞细菌和产孢子的微生物，只需将它们制备成悬液，选择合适的稀释度，就能达到分离目的。◇不产孢子的多细胞微生物(许多是异核的)，需要用原生质体再生法进行分离纯化。自然选育分以下几步进行:⑴通过表现形态来淘汰不良菌株这主要是从菌落形态包括菌落大小、生长速度、颜色、孢子形成等可直接观察到的形态特征，来加以分析判断，去除可能的低产菌落，将高产型菌落逐步分离筛选出来。如抗生素菌种的选育：„长缓慢，菌落过小，产孢子少；孢子生长及孢子颜色不均匀，产生白斑、秃斑或角变。或生长过于旺盛，菌落大，孢子过于丰富等。„高产菌的菌落：孢子生长有减弱趋势，菌落中等大小，菌落偏小但孢子生长丰富，孢子颜色有变浅趋势，菌落表面沟纹整齐，多、密且较直；分泌色素或逐渐加深或逐渐变浅。低产菌的菌落：不产生菌丝，菌落多光秃型；生⑵通过目的代谢物产量的考察在第一步初筛的基础上，对选出的高产菌落进行复筛，进一步淘汰不良菌株。⑶进行遗传基因型纯度试验，以考察菌种的纯度将复筛后得到的高产菌种进行分离，再次通过表观形态进行考察，分离后的菌落类型愈少，则表示纯度愈高，相似的主要菌落(主型)占90％以上，表明其遗传基因型分离少而较稳定。⑷传代的稳定性试验在生产中根据生产规模需要逐级扩大菌种，必然要经过多次传代，这就要求菌种具有稳定的遗传性。在试验中一般需要进行斜面传代3～5次的连续传代，产量仍保持稳定的菌种方能用于生产。1.3诱变育种定义：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。优点：由于采用了诱变剂处理，大大提高了菌种发生突变的频率和变异幅度。加快了菌种选育的速度，大大提高了获得优良菌株的机率。1940s初，利用x射线诱变青霉菌获得了青霉素高产突变菌株，使诱变育种成为工业微生物育种的一种强有力的手段。◇基因工程重组：耗费的人力物力较大，许多工业发酵产物受多基因控制，且在大多数情况下，对参与生物合成的基因的结构、功能以及代谢途径的酶学与生物调控机制等了解不够。◇诱变育种：对一般发酵产品来说，诱变育种仍然是一种较为经济高效的菌种选育手段。1.3.1突变微生物的染色体上的遗传信息及染色体组受到环境的作用而发生改变，这种改变或多或少是永久性的。从生物表型上说是突然发生的可遗传的变化，这种变化就称为突变。带有这种变化的菌株称为突变菌株。★突变类型：基因突变：只涉及少数核苷酸碱基的改变，称为点突变或微小损伤；染色体畸变（或染色体突变）：涉及一大段核苷酸或染色体的突变。„自发突变：在自然状况下发生的突变，频率极低，对育种不利；„诱发突变：人为地用物理或化学因素诱发的突变，突变率可以大大提高。可以提高突变频率的物理或化学因素，称为诱变因素或诱变剂。1.3.2诱变的基本原理★诱变剂作用机理★常用诱变剂★诱变剂作用机理微生物经诱变剂处理后，其遗传物质可发生点突变和染色体畸变。◇基因突变(点突变)包括转化、颠换、添加或缺失等；◇染色体畸变包括缺失、倒位、重复、易位及染色体数目的变化等。★诱变剂的种类物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂◆物理诱变因子紫外线：不形成离子的非电离辐射；在微生物育种中是一种最常用而且效果显著的诱变剂。快中子、60Co、γ-射线、β-射线：产生电离辐射。紫外线诱变的作用主要是引起：DNA链的断裂、DNA分子内和分子间发生交联；核酸与蛋白质的交联；胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用；嘧啶二聚体的形成；胸腺嘧啶二聚体的形成◇光复活作用（直接复活）：紫外线照射后造成的DNA损伤在可见光下可以被修复。这是通过光激活酶而发生的，该酶可以使胸腺嘧啶二聚体解开而重新成为单体。◇黑暗复活（间接光复活）：不需要光照，细胞在黑暗中减慢了大分子的合成速度，有利于某些细菌能够产生恢复紫外线损伤的DNA的酶，该酶的产生不需可见光，它包含特殊的核酸酶，把含有胸腺嘧啶二聚体的DNA链形成单链，切断二聚体，修复、复制而形成新的DNA的双螺旋。◆X射线和γ射线：通过具有高能量的次级电子产生电离作用引起微生物变异;引起点突变以及染色体倒位、易位、缺损、重组及其他畸变。◆快中子：目前应用较好的诱变剂。中子不直接产生电离，而从吸收中子的物质的原子核中撞击出质子来，因而其生物学效应是由质子造成的。快中子比X射线和γ射线具有较大的电离密度，因而能够更多地引起基因突变和染色体畸变。★化学诱变剂的诱变机制化学诱变剂包括金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢产物、生长刺激素、抗生素以及高分子化合物，还包括医药、农药灭菌剂、洗涤剂、染料、饮料、食品等日常生活用品。什么食品？？化学诱变因素对DNA的作用形式：◇与一个或多个核酸碱基起化学反应，引起DNA复制时碱基配对的转换而发生遗传变异的烷化剂类的化合物，如亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲等。◇与天然碱基十分接近的结构类似物。它们掺入DNA分子中而引起变异，称为碱基类似物诱变剂。如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤和6-氯嘌呤等，通过代谢作用掺入到DNA分子中。◇在D