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Rotor-Gene6000荧光定量PCR仪仪器概述Rotor-Gene6000采用转子式设计的检测系统用于检测、定量和对样品的基因型进行分析Rotor-Gene6000的升降温示意图。Rotor-Gene6000具有转子式设计样品以400rpm持续离心，防止样品凝结，除去气泡，省去了反应前离心步骤。样品在空气仓内加热和降温。通过盖上的镍铬线圈加热。通过顶部气孔将热空气排出，底部风扇吹入冷空气实现降温。Rotor-Gene6000光学系统示意图。可自选的6个激发光源和6片检测滤镜样品由反应仓底部的的发光二极管激发能量通过薄壁管底部激发染料发射荧光通过反应仓侧壁的发射滤镜由光电倍增管收集光信号常用配件36-孔转子36-孔转子压环72-孔转子72-孔转子压环Rotor支架准备一个反应1.选择转子类型36孔转子及压环，使用0.2ml的管子，在实验中最为常用。管子无需是顶部透明的，因为荧光信号是由管底部检测的。现在同样可以使用圆盖的管子。72孔转子和压环，使用0.1ml的四联管，它允许最小达5ul的反应体积。它的盖子提供了安全可靠的密封性准备一个反应2.反应设置将反应管插入样品板、分装试剂盖好管盖，确保盖紧。准备一个反应将三针压环固定在转子上，压环保证了反应中盖子与管子的紧密结合。反应管插入相应的转子，确保每个管子都正确放置，可选配转子支撑架以便于管子的放置。为了达到最大的温度均一性，转子中的每个孔都必需放置有管子。将插好管子的转子固定在Rotor-Gene的中心转轴上。轴上的位置指针保证转子的正确安装。要拆下转子，只需推动上部的转子杆即可释放转子。设置一个运行新的反应可用快速启动进行设置。快速启动向导使操作者能够尽快的完成设置，开始一个反应，向导内含有多个程序模板，它们包括了默认的循环条件下及采集通道。第一步是选择一个运行模板：PerformLastRun:从上一个反应中导入循环设置、通道设置及样品定义。ThreeStepwithMelt：三步法并运行熔解曲线，信号采集为FAM/SYBR通道。TwoStep：双标记探针，默认两步法，信号采集为所有通道。设置一个运行选择转子类型选中压环已盖紧的小框，以继续向导操作设置一个运行可输入操作者的名字及注释信息必需输入PCR反应体积。反应体积为20-25uL设置一个运行修改温度循环通道设置点击EditProfile编辑键进入编辑器以修改循环条件及选择采集通道设置一个运行流程编辑器在选中的循环后插入一个循环在选中的循环前插入一个循环从流程中删除选中的循环设置一个运行设定循环的重复数设定温度/时间窗口中显示了每一个循环点击左侧温度和时间指示并进行修改通过右侧的+/-键进行添加或删除循环设置一个运行采集可在循环中的任一步，任一个通道设置点击NotAcquisition键。点击后，会显示采集窗口。设置一个运行染料通道选择表可以根据使用的染料找出相应的通道要设置采集通道，只需将可用通道列表中的通道添加到采集通道中即可设置一个运行完成设置后点击Calibrate校正…键以进入增益值校正窗口设置一个运行自动增益校正让机器自动进行校正，直至所有选中的通道的荧光读数都落在一个阈值范围内；优化所有/优化采集：“优化所有”将校正软件所知的所有通道。选择“优化采集”将只校正该反应中所用到的通道（循环和熔解）；通道设置：这是一个下拉式的菜单，允许你向增益值校正窗口中添加新的通道，选中需要的通道并点击添加。设置一个运行总结反应的总体情况。确定参数设置。点击StartRun开始反应。设置一个运行此时会弹出文件保存Saveas窗口该文件包括一次运行的所有信息设置一个运行当反应开始后，可以在等待反应完成的这段时间里输入样品的类型及描述。这一界面的功能与样品编辑器完全一致。你同样也可以在反应结束后对样品进行编辑。程序运行后，可以在软件界面上实时观察到如下的窗口：显示原始的荧光信号收集界面，温度界面和反应进程界面，窗口右边是样品信息栏。通过此界面可以实时检测PCR反应，反应剩余时间，以及升降温情况。原始的荧光信号收集界面温度界面反应进程界面反应完成后，可通过“Analysis”键，对结果进行分析。选择所需要的分析方法，如：定量分析，熔解曲线分析等之后，按Show键，则可以在窗口中看到相关图表结果。“Other…”里有其他分析方法。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介1.先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近，将扩增效率优化为一致；2.同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即Ct。由于Ct值处于指数期内，这时的反应成分不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确的反映反应体系中模板的初始量。假定的例子介绍使用Delta-deltaCt法来决定一个目标基因（p53）在肿瘤和正常卵巢组织的表达的相对水平。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介例子：正常和肿瘤组织50ngRNA得到的cDNA用来分析p53（目标基因）和GAPDH（参照基因）。研究表明GAPDH在正常和肿瘤组织中没有差异。样品Ctp53（目标基因）CtGAPDH（参照基因）正常（校准样本）15.016.5肿瘤（试验样本）12.015.9进行相对定量分析之前，在检测和校准的样品中靶基因的Ct值和内参的Ct值进行归一化：△Ct（正常）=15.0-16.5=-1.5△Ct（肿瘤）=12.0-15.9=-3.9然后，试验样本与校准样本的△Ct值进行归一化△△Ct=△Ct（肿瘤）-△Ct（正常）=-3.9-(-1.5)=-2.4最后，计算表达比率：2-△△Ct=2-（-2.4）=5.3因此，肿瘤组织细胞的p53表达水平比正常细胞高5.3倍。ComparativeDelta-deltaCt法的特点、注意事项1).ComparativeDelta-deltaCt法是常用的相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。2).其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。3).ComparativeDelta-deltaCt法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介应用实例：将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因和看家基因做标准曲线软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。两组标准曲线的M值的差值0.1ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果：为进行ComparativeDelta-deltaCt分析，需要对样品进行一些编辑。简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。可通过NEW新建一个page，并通过Selected选择每页中分析的对像。将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示：ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介Page2：目的基因，其中10-18号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。Page1：看家基因，其中1-9号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介样品编辑好后就可进行分析工作。通过进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要在荧光曲线图中上下拖动光标即可。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介完成两页分析之后，再进入DeltaDeltaCT分析界面，选择show，此时，软件的向导界面会提示使用者一步完成设置：第一项：ValidationRunPerformed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。选择Yes；第二项：GeneofInterestQuantitation，选中Page1或Page2中编辑了目的基因的那一页；第三项：NormaliserQuantitation，选中Page1或Page2中编辑了看家基因的那一页；第四项：CalibratorDefined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。ComparativeDelta-deltaCt定量流程简介完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对于对照组A的比值。双标准曲线法定量流程1).用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准曲线，必需有一组稳定的标准品。2).同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页上。双标准曲线法定量流程双标准曲线法定量流程双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用1.双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格的优化。2.其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。3.并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。双标准曲线法定量流程样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线；待测样品A、B、C，15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。双标准曲线法定量流程在用双标准曲线法做相对定量之前，同样需要对样品进行一些编辑。方法与Delta-deltaCT法类似，即将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。Page1：看家基因，其中7-12号管为标准曲线，通过YES选中，15-17号管为待测样品，分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可不以不进行编辑。Page2：目的基因，其中1-6号管为标准曲线，通过YES选中，18-20号管为待测样品，分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可不以不进行编辑。双标准曲线法定量流程样品编辑好后就可进行分析工作，从Other进入，选择2StandardCurvesRelativeQuantitation。根据提示向导依次完成设置。依次选中目的基因的page、看家基因的page以及对照组（例，以A为对照组）双标准曲线法定量流程结果包括计算所得的各标准品及待测样品的浓度以及样品B、C的目的基因