微生物挑战性实验方法

微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0范围公司新产品3.0参考：4材料与方法4.1化妆品中常用的防腐体系[6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4.2微生物挑战性实验4.2.1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括:黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。实验前，将各菌种接种于合适的培养基中,于37℃(细菌)或28℃(霉菌)下培养。细菌培养在2天后,霉菌培养在3-5天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌(1×108个/ml)或混合霉菌悬液(1×107个/ml),置于4℃贮放备用。4.2.2一次加菌的28天微生物挑战试验此方法参照美国药典(第21版)上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g,加入混合细菌或混合霉菌悬液,每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3×105个霉菌。然后充分混匀,置于28℃下。在接菌的0、7、14、21和28天取样分析:准确称取3g样品,加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内,加入27ml灭菌生理盐水,充分震荡混匀,此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量,细菌培养是37℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为:当每克样品中一次接菌(1×106细菌和1×105霉菌)后,在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0.1%,以后逐渐减少,在28天为0。符合标准为防腐剂有效(通过测试),不符合为防腐剂无效(不通过测试)。分析与检测4.2.3重复3次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CTFA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g,每隔2周加菌一次(即实验的第1、3和5周),每次加细菌量为1×106～1×107个/g样品和霉菌1×105个/g～1×106个/g样品。在加菌后的0天、7天和14天(后一次加菌前)采样分析样品中含菌量,方法同前。此方法可将受检样品分为三类:(1)防腐效果优良(W),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量减少至不高于起始浓度的0.01%(即≤100个/g或ml）样品,通过测试)。(2)防腐效果尚可(M),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量减少至不高于起始浓度的0.1%,(即≤1000个/g或mL样品,通过测试)。(3)防腐效果差(P),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量mL样品(不通过测试)。5、结果判断受试样品一次加菌和3次加菌后,在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准,将8种防腐体系的防腐效果评判列于表5。从结果看,两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致,三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别:防腐优良(W:Wepreservative)和防腐尚可(M:Marginapreservative)。此外,在一次加菌后1～2周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0.1%,可通过3次加菌实验,如防腐体系5和8对细菌的防腐力;但若大于0.1%,即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0的趋势,可能亦很难通过3次加菌实验,如防腐体系7对细菌的防腐力。参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示）(注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）2.3试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。（3）霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数CTFA(美国化妆品香料香精协会)推荐化妆品微生物挑战用菌种类菌种名称拉丁名称推荐菌种编号要求价格（元/支）革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538(CICC10306)至少选一种2000表皮葡萄球菌S.epidermidis发酵型革兰氏阳性杆菌肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeATCC4352(CICC21519)至少选二种600阴沟肠杆菌Enterbactercloacae大肠埃希氏菌EscherichiacoliATCC8739(CICC10302)2000日勾维肠杆菌E．gergoviae变形菌属Proteussp．非发酵型革兰氏阳性杆菌铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaATCC9027(CICC10351)至少选一种2000洋葱假单胞菌P．cepacia荧光假单胞菌P．fluorescens恶臭假单胞菌P．Putida黄杆菌属Flavobatcteriumsp．不动杆菌属Acinetobactersp．酵母菌白色假丝酵母CandidaalbicansATCC10231(CICC1943)至少选一种2000近平滑假丝酵母C.parapsilosis霉菌巴西曲霉AspergillusbrasiliensisATCC16404(CICC2463)至少选一种2000黄绿青霉Penicilliurnluteum